Por que usar o coquetel CEPT em minhas culturas de células-tronco?
As células-tronco pluripotentes induzidas (iPSC pela sigla em inglês) são células que, após serem tratadas com certos fatores de transcrição, têm o potencial de gerar células de qualquer tipo de tecido. Foi possível produzir iPSC humana em 2008, e desde então tem sido considerada de grande interesse para o estudo de diferentes doenças, tendo sido atribuído o Prémio Nobel de Medicina de 2012 aos criadores desta técnica.
As iPSCs, em princípio, podem se expandir indefinidamente em cultura e se diferenciar para formar praticamente qualquer tipo de célula humana. Isso lhes dá um potencial muito alto para ajudar na pesquisa médica. Facilita o estudo de vias metabólicas e de sinalização específicas e também pode gerar modelos celulares de doenças raras. Na área de desenvolvimento de medicamentos, permitem a realização de testes de eficácia e toxicidade em modelos humanos.
Esses modelos variam em complexidade, variando desde células em monocultura, coculturas de diferentes tipos gerando estruturas complexas semelhantes a tecidos, até estruturas tridimensionais que simulam órgãos chamados organoides.
A cultura de células humanas envolve diferentes dificuldades técnicas, e a pesquisa com iPSCs apresenta desafios consideráveis. Por um lado, é importante preservar a estabilidade genômica e a memória epigenética de uma linhagem pluripotente, uma vez estabelecida. Para isso, é necessário fornecer os nutrientes que permitem que o crescimento das células seja mantido, mas evitam sua diferenciação, e fornecer o suporte mecânico adequado. Uma técnica utilizada é a cocultura com fibroblastos, sendo menos exigente a alternativa de utilização de matrizes extracelulares e meio químico.
Outros desafios existentes estão relacionados à passagem da dissociação de uma linhagem para células individuais, a fim de expandi-las, criopreservá-las ou cloná-las. As células dissociadas sofrem condições de estresse, resultando em baixa sobrevivência, aumento do acúmulo de anormalidades genéticas e baixa eficiência de clonagem.
No Laboratório de Tradução de Células-Tronco dos Institutos Nacionais de Saúde dos EUA (NIH) foi desenvolvida uma combinação de quatro pequenas moléculas, CEPT (Croman 1, Emricasan, Poliaminas e Trans-ISRIB) que melhoram a sobrevivência das linhagens de iPSC.
O Croman 1 foi selecionado como o melhor inibidor de ROCK1 e ROCK2, que bloqueia a contração celular que em células dissociadas pode levar à apoptose e anoikis. Quando combinado com o inibidor pan-caspase Emricasan, que interfere com a apoptose, a taxa de sobrevivência celular foi aumentada.
Na busca de uma molécula que ajudaria a sobrevivência sob condições de baixa densidade celular, foi selecionado o trans-ISRIB, um inibidor seletivo da resposta integrada ao estresse (ISR) que regula a tradução de proteínas no nível de eIF2B (fator de iniciação eucariótica 2B), permitindo que a síntese prossiga. Ao adicionar uma mistura de poliaminas como policátions que estabilizam estruturas celulares e macromoléculas e modulam algumas funções, como transcrição, tradução e resposta ao estresse, um efeito positivo foi observado.
A combinação desses quatro fatores exibiu um efeito sinérgico no aumento da sobrevivência celular, adesão e tradução de proteínas em uma cultura. Após várias passagens, constatou-se que as células mantêm seus marcadores pluripotentes e podem se diferenciar quando dadas as condições adequadas. Ao adicionar CEPT durante o descongelamento, a viabilidade celular foi melhorada, enquanto a criopreservação das células com CEPT alcançou melhor sobrevivência após longos tempos de armazenamento.
Na Fujifilm Wako, oferecemos o coquetel CEPT (033-26071), produzido sob licença do NIH, como uma preparação pronta para uso. A preparação pode ser adicionada ao meio de cultura durante a passagem de rotina, criopreservação e descongelamento, clonagem unicelular, processos de edição de genes e engenharia de tecidos, melhorando significativamente a sobrevivência celular.
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Bibliografia
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