Kit para extração de DNA (Método de iodeto de sódio)

Método com a utilização de iodeto de sódio

Para a detecção e mensuração do DNA em líquidos, este precisa ser isolado das proteínas da amostra. Geralmente, o procedimento é o PK-SDS. Este procedimento emprega a digestão da protease K na presença de SDS, seguida de extrações com solventes orgânicos. Embora permita a obtenção de DNA de alta qualidade, este procedimento requer um trabalho que leva muito tempo e o uso de solventes tóxicos como o fenol e o clorofórmio.

O kit para extração de DNA da Wako utiliza um procedimento de extração para a purificação do DNA do soro humano em um só tubo. Este procedimento emprega o iodeto de sódio (NaI) como agente caotrópico e permite o isolamento de DNA de alta qualidade e alta recuperação dos líquidos biológicos sem necessidade de manipulações complexas e trabalhosas.

Outro produtos:

• Kit para isolamento de DNA PS

DADOS

 CONTEÚDO (50 TESTES)

MATERIAIS NECESSÁRIOS

PRINCÍPIO DA EXTRAÇÃO DE DNA

Uma alta concentração de caotrópico, NaI, e um detergente aniônico participam da solubilização das proteínas e lipídios contidos nas amostras biológicas. Após a adição de isopropanol à mistura, os ácidos nucleicos são precipitados concomitante com glicogênio polissacarídeo como carreador, enquanto todos os componentes permanecem solúveis na fase de solução.

Armazenamento:

Em temperatura de 2-10ºC.

PROCEDIMENTO DE EXTRAÇÃO DO DNA DO SORO

Preparação dos reagentes

1.      Antes da extração do DNA, é necessário preparar a seguinte solução: Diluir 26mL de solução de NaI (um frasco) com 6mL de água destilada deionizada. Acrescentar 1mL de solução de N-Lauril sarcosinato de sódio e 65µL de solução de glicogênio e misturar bem.

2.      Acrescentar 2µL da solução de glicogênio à solução de lavagem (B) e misturar bem.

Observações técnicas

A água destilada deionizada para diluição da solução NaI não deve conter DNA. A solução de lavagem (B) preparada é estável por, pelo menos, 1 semana à temperatura de 4ºC. Quando utilizar um pequeno volume de solução de lavagem (B), acrescente solução de glicogênio em volume adequado em um tubo esterilizado. A solução de NaI pode cristalizar durante o armazenamento. Aqueça a solução à 50ºC para auxiliar a dissolução.

Procedimento de extração de DNA

1. Coloque 100µL do soro em um tubo estéril de plástico de 1,5mL para microcentrífuga.
2. Adicione  300µL da solução preparada de NaI ao tubo e misture.
3. Incube o tubo em um bloco aquecido a 60ºC por 15 minutos.
4. Remova o tubo do bloco aquecido, e acrescente 400µL de isopropanol ao tubo e misture bem.
5. Depois de deixar o tubo permanecer na vertical por 15 minutos em temperatura ambiente, centrifugue o tubo (10,000 g x 15 minutos).
6. Remova o máximo possível de sobrenadante do tubo. Depois da remoção do sobrenadante, coloque o tubo invertido em um filtro de papel e remova o líquido residual da parede do tubo.
7. Ressuspenda a massa branca resultante em 1mL de solução de lavagem (B) preparada e centrifugue até que massa se solte da parede do tubo.
8. Depois de uma rápida centrifugação (10.000 g x 5 minutos), descarte o sobrenadante do tubo, e leve a massa resultante para secagem a vácuo. Essa massa contém o DNA para análise.

PRÉ-TRATAMENTO DA AMOSTRA PARA ANÁLISE TOTAL DE DNA EM SISTEMAS THRESHOLDÄ*

Preparação dos reagentes

1. Acrescente 65µL de solução de glicogênio em 26mL de solução de NaI (um frasco).
2. Acrescente 65µL de solução de glicogênio em 40mL de solução de lavagem (B), misturando imediatamente.

Observações técnicas

A solução de lavagem (B) preparada é estável por, pelo menos, 1 semana à temperatura de 4ºC. Quando utilizar um pequeno volume de solução de lavagem (B), acrescente solução de glicogênio em volume adequado em um tubo esterilizado. A solução de NaI pode cristalizar durante o armazenamento. Aqueça a solução à 50ºC para auxiliar a dissolução. O procedimento de extração deve ser realizado antes da desnaturação do DNA por calor. Portanto, é importante utilizar uma técnica asséptica para reduzir a contaminação do DNA. Pontas, tubos e luvas estéreis devem ser usadas durante todo o procedimento.

Procedimento de extração de DNA

1. Coloque 500µL da amostra em um tubo estéril de plástico de 2mL para microcentrífuga com a tampa.
2. Adicione  20µL da N-Lauril sarcosinato de sódio ao tubo e misture.
3. Acrescente 500µL da solução contendo glicogênio à mistura, gire e incube a 40ºC por 15 minutos.
4. Acrescente 900µL de isopropanol à mistura, centrifugue e deixe o tubo permanecer na vertical por15 minutos em temperatura ambiente.
5. Depois de uma rápida centrifugação (10.000 g x 5 minutos), uma massa branca poderá ficar visível. O sobrenadante resultante deve ser descartado e a solução remanescente no tubo deve ser removida colocando-se o tubo invertido em um filtro de papel.
6. Acrescente 800µL de solução de lavagem (A) ao tubo e gire vigorosamente para soltar a massa da parede to tubo.
7. Depois da centrifugação (10.000 g x 5 minutos), o sobrenadante resultante deve ser drenado.
8. Acrescente 1500µL de solução de lavagem (B) contendo glicogênio ao tubo e centrifugue. Depois da centrifugação (10.000 g x 5 minutos), descarte o sobrenadante. A massa resultante conterá DNA e glicogênio carreador.
9. Reconstitua a massa em Calibrador zero.

Observação técnica

Se a amostra contiver DNAase, a etapa 2 deve seguir a etapa 3. Se a amostra for insolúvel ou sair da solução durante a refrigeração , aumente a temperatura da incubação para 40-60ºC. No entanto, pode ocorrer agregação em amostras de alta concentração.

REFERÊNCIAS:

Ishizawa, M., Kobayashi, T., and Matsura, S., "Simple Procedure of DNA Isolation from Human Serum," Nucleic Acids Res., 19 (1991) 5792.

Workman, Wesley E., "Sample Preparation and Residual DNA Analysis of Biopharmaceuticals," Pharmacopeial Forum, 21 (March-April 1995) 479-484.

*Note:     Light addressable potentiometric sensor (LAPS) system for the quantitation of DNA and proteins in biopharmaceuticals. Produced by Molecular Devices Corp. (Sunnyvale, CA).