Seis reagentes de laboratório para detecção de microrganismos

A detecção de microrganismos é necessária para o controle da qualidade de amostras de alimentos, água, ar; assim como para a indústria biotecnológica no desenvolvimento de medicamentos e produção de bioderivados. Existem vários métodos para saber se uma amostra está contaminada por microrganismos, desde os métodos mais convencionais desenvolvidos há décadas, até os reagentes que possibilitam uma análise rápida e específica do microrganismo em questão, ou de alguma substância relacionada com sua presença.

Neste artigo são descritas as características de seis reagentes comercializados pela empresa Wako para a detecção de microrganismos.

Detecção de endotoxina utilizando o Teste Limulus ES-II da Wako

A determinação da endotoxina é muito importante devido ao papel que esta substância desempenha nas doenças causadas pelas bactérias Gram-negativas. A endotoxina é conhecida como a toxina que é liberada ao romper-se a parede celular destas bactérias, que em sua maior parte é formada por polissacarídeos, O corpo humano tem a capacidade de ativar a resposta imune frente à cadeia de polissacarídeos provenientes da destruição bacteriana, mas não atua contra o lipídeo A, que é responsável pelos efeitos da endotoxina sobre a saúde.

Desde o descobrimento do ensaio do lisado de amebócitos de Limulus (LAL), este tem sido muito utilizado pela indústria farmacêutica, no controle de qualidade de alimentos e na qualidade do meio ambiente, entre outras numerosas aplicações. A concentração de endotoxina utilizando esse ensaio pode ser medida pelos métodos de coagulação em gel, cromogênicos e cinéticos turbidimétricos.

Nos últimos anos, testes de LAL específicos para endotoxina têm sido desenvolvidos, pois se descobriu que o β-1,3-glucano e a celulose interferiam na determinação da endotoxina. O β-1,3-glucano (polissacarídeo de glicose presente na parede celular de bactérias e fungos) ativa a cascata de reações enzimáticas no LAL, através de um mecanismo diferente daquele da endotoxina. Além disso, somente atua como interferente quando se encontra em concentrações baixas. No excesso de β-1,3-glucano, a medição de endotoxina com LAL, é específica a ela.

O uso do Teste Limulus ES-2 da Wako permite a quantificação da endotoxina por gelificação ou por turbidimetria. Quanto maior a concentração de endotoxina no meio, menor é o tempo de gelificação, sendo este um parâmetro que pode ser aproveitado para quantificar a endotoxina presente. Consegue-se eliminar a interferência causada pela o β-1,3-glucano, acrescentando Curdlan carboximetilada ao tampão ES desenvolvido previamente pela Wako, daí o nome deste teste (ES-II). O Curdlan fornece uma concentração de β-1,3-glucanos de alta a média, que faz com que não existam interferências na medição das endotoxinas.

Curdlan

O Curdlan foi descoberto por Harada e sua equipe ao isolar uma cepa mutante de Alcaligenes faecalis var. myxogenes 10C3 que produzia este polissacarídeo, com propriedade gelificantes. Sua estrutura química é a de um polímero de glicose, com ligações glicosídicas β-1,3. O pH ideal para a formação de gel deste glucano fica entre 2 e 3. As propriedades de Curdlan como gelificante têm sido aproveitadas na indústria alimentícia, onde ele é utilizado como aditivo, na construção e na indústria farmacêutica. Tem-se pesquisado o papel desta molécula nos mecanismos que regulam os processos alérgicos em humanos, considerando-se uma droga em potencial para tratar esta condição médica e também se tem estudado sua atividade antitumoral.

O Curdlan é utilizado como gel de suporte em cromatografia de afinidade, para imobilização de enzimas, filtração, etc. Na detecção de microrganismos, tem um papel fundamental no Teste Limulus ES-2 da Wako, já que impede a obtenção de dados errados na determinação da endotoxina. Sua utilização neste teste se baseia no fato de que os β-1,3-glucanos agem como interferentes na medição da endotoxina somente quando se encontram em concentrações baixas no meio, mas se a sua concentração é muito alta, não interferem na medição. Além disso, o mecanismo que desencadeia a cascata de reações enzimáticas para se obter o gel de LAL é diferente quando é ativado por endotoxina ou por β-1,3-glucanos, possibilitando uma medida segura e confiável da concentração de endotoxina ao eliminar a interferência de β-1,3-glucanos, com o acréscimo de Curdlan.

Uso do Teste Limulus Color KY para a detecção de endotoxinas

Como foi descrito anteriormente, a determinação de endotoxinas, utilizando o ensaio de LAL, pode ocorrer por gelificação, ou mediante técnicas fotométricas quantitativas (turbidimetria e colorimetria).

O Teste Limulus Color KY se baseia na técnica colorimétrica para a determinação específica da quantidade de endotoxina presente no meio.

A técnica colorimétrica para a detecção de endotoxina consiste na medição de um cromóforo liberado por um peptídeo depois da fase de incubação.

Detecção da micotoxina Patulina

A Patulina é uma micotoxina (toxina proveniente de bolores) produzida por algumas espécies de Penicillium y Aspergillus. Embora as micotoxinas sejam conhecidas principalmente por afetar os grãos em geral, esta micotoxina é encontrada em frutas, como maçã e pera. É um patógeno que ataca a fruta depois de ser colhida e é resistente aos tratamentos com calor, por isso pode estar presente em sucos e concentrados de frutas industriais. Na verdade, esta micotoxina não é especialmente tóxica, mas se transformou em um parâmetro de análise da qualidade do suco de maçã e outros concentrados derivados desta fruta, pois a presença em concentrações maiores do que as habituais indica que foram usadas maçãs emboloradas para a produção do suco/alimento. Sabe-se que a principal fonte de contaminação por esta micotoxina é o suco de maçã. O limite de concentração de Patulina permitido no suco de maçã e derivados é de 50ppb. Este reagente serve como padrão para a medição de Patulina no suco de maçã e em outros concentrados.

Peptidoglicano de micrococcus luteus

O peptidoglicano é o componente da parede celular das bactérias que proporciona resistência e estabilidade a elas. É uma estrutura cristalina, também conhecida como mureína. Este polímero contém açúcares (resíduos de N-acetilglucosamina e ácido N-acetilmurâmico unidos por uma ligação glicosídica do tipo β-(1,4)) e aminoácidos.

A quantidade de peptidoglicano que se encontra na parede celular de uma bactéria é uma prova definitiva para classificá-las como Gram-positiva ou negativa, pelo fato de que o resíduo sólido da parede celular das bactérias Gram-positivas tem sua maior parte constituída por peptidoglicano, enquanto que nas Gram-negativas este componente é minoritário. Por este motivo, o peptidoglicano pode ser um reagente útil para ser utilizado como padrão na detecção de microrganismos, além de suas aplicações nas pesquisas relacionadas à indústria farmacêutica e biotecnológica.

O peptidoglicano de micrococcus luteus pode ser usado como reagente padrão para o Kit de reagentes SLP da Wako, que passaremos a descrever a seguir. Este peptidoglicano causa pirogenicidade e reatividade no fluído corporal do bicho da seda (reagente de SLP).

Kit de reagentes SLP

O kit de reagentes SLP comercializado pela Wako tem como finalidade a detecção e a medição quantitativa de peptidoglicano y (1→3)-β-glucano. Estas duas substâncias, que formam parte da parede celular de bactérias e fungos, respectivamente, têm a capacidade de ativar a cascata proteolítica denominada sistema de ativação da profenoloxidase (proPO). A enzima fenoloxidase participa da biossíntese da melanina ao oxidar os compostos fenólicos de quinonas, que posteriormente se transformam através de via não enzimática na melanina. Este processo tem um papel importante nos mecanismos de defesa dos organismos dos insetos.

Nos invertebrados, esta cascata de reações proteolíticas que converte a profenoloxidase em fenoloxidase é ativada na semolina, como é o caso do bicho da seda (Bombyx mori). Este kit de reagentes contém o plasma da larva do bicho da seda (SLP, silkworm larvae plasma, em inglês, de onde provém o nome) em que se encontram as proteínas de reconhecimento específicas para peptidoglicano y (1→3)-β-glucano. Os complexos formados por estes compostos e as proteínas de reconhecimento ativam a formação dos precursores de serina-protease, Os complexos se juntam às serina-proteases que induzem à formação de fenoloxidase.

A quantidade de fenoloxidase formada, que é proporcional à quantidade de peptidoglicano o (1→3)-β-glucano presente no meio, pode ser determinada com o kit de reagentes de SLP, mediante à adição de 3,4-dihidroxifenilalanina (DOPA). A DOPA é oxidada pela fenoloxidase formando como produto final a melanina, que pode ser determinada por testes colorimétricos.

Em resumo, a Wako oferece uma série de reagentes que são capazes de detectar bactérias e fungos pela formação de melanina. No caso de precisar de uma prova qualitativa da presença destes microrganismos se pode observar a olho nu pela mudança de cor obtida na amostra. Caso se queira obter uma medida quantitativa da quantidade de peptidoglicano o (1→3)-β-glucano presente, pode-se utilizar um instrumento de medida colorimétrica, como o Toxinômetro, comercializado pela Wako.

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