Proteínas fluorescentes

O uso de proteínas fluorescentes para marcar as estruturas celulares e proteínas é de vital importância para a pesquisa de todos os ramos da biologia. Ter uma ampla gama desses compostos permite que os pesquisadores desenhem experimentos para aproveitar métodos ópticos sofisticados.

Fujifilm Wako distribui os produtos de vários parceiros colaboradores, dentre eles a linha de proteínas fluorescentes (FPs) da empresa Evrogen, que abrange uma ampla variedade de proteínas. As proteínas fluorescentes podem ser usadas em ensaios com células vivas, para marcar estruturas ou subestruturas celulares, além de marcar outras proteínas específicas quando elas se ligam a outras biomoléculas e, além disso, para gerar linhas celulares transfectadas que expressam essas proteínas. O desenvolvimento que tem sido realizado nas últimas décadas dos diferentes métodos ópticos de análise, incluindo a microscopia, torna as proteínas fluorescentes cada vez mais úteis e que os pesquisadores demandem proteínas mais específicas, a fim de obter novos resultados e estudar o processos e funções celulares com maior profundidade. Com o uso de proteínas fluorescentes é possível "ver" os processos que ocorrem em escala microscópica e estes resultados nos ajudam a entender processos que até agora eram desconhecidos. Daí a importância deste maravilhoso grupo de substâncias, cuja característica comum é a sua capacidade de brilhar quando são irradiadas com o comprimento de onda correto.

Os subgrupos em que estão divididas as proteínas fluorescentes da marca Evrogen são descritos abaixo:

1.  Tag FPs

Proteínas fluorescentes monoméricascom uma gama de cores variando de azul a vermelho-claro, oferecem possibilidades únicas para a marcação multicolorida de estruturas subcelulares.

• TagBFP: Proteína monomérica azul fluorescente, estável a alterações de pH, recomendada para marcação de proteínas, marcação de organelas ácidas e aplicações FRET (Förster Resonance Energy Transfer).        
• TagCFP: Proteína monomérica fluorescente cor ciano, gerada com base semelhante à proteína GFP (por sua sigla em inglês, Green Fluorescent Protein) produzida naturalmente na água-viva Aequorea macrodactyla [Xia et al., 2002]. Está provado que pode gerar linhas celulares transfectadas de forma estável, é recomendado para a marcação de proteínas, células e organelas. Da mesma forma que para estudos da interação e rastreamento de promotores.
• TagGFP2: Proteína monomérica verde fluorescente, variante melhorada de TagGFP, o mutante da proteína similar a GFP de Aequorea macrodactyla [Xia et al., 2002, Subach et al., 2008]; usado para a marcação de proteínas e aplicações FRET.
• TagYFP: É uma proteína monomérica amarela fluorescente, desenvolvida com base na proteína similar à GFP produzida naturalmente na água-viva Aequorea macrodactyla [Xia et al., 2002]. Está provado que pode gerar linhas celulares transfectadas de forma estável e é recomendado para a marcação de proteínas.
• TagRFP: Proteína monomérica vermelha (laranja) fluorescente gerada a partir da proteína RFP do tipo selvagem produzida na anêmona do mar Entacmaea quadricolor [Merzlyak et al., 2007]. Está provado que pode gerar linhas celulares transfectadas de forma estável e é recomendado para a marcação de proteínas, organelas ácidas e aplicações FRET.
• FusionRed:  Proteína monomérica vermelha fluorescente caracterizada por melhorar o rendimento em fusões e sua menor toxicidade. Não tem tendência a dimerizar em altas concentrações, como outras proteínas fluorescentes vermelhas, o que garante maior eficiência na marcação de proteínas, especialmente em células com alta expressão. Está provado que pode gerar linhas celulares transfectadas de forma estável e é recomendado para a marcação de proteínas e experimentos de longo prazo.
• mKate2: Proteína monomérica vermelho distante fluorescente, facilmente distinguível de qualquer sinal fluorecente de fundo. Pertence à próxima geração de proteínas vermelho distante fluorescentes, recomendada para marcação de proteínas, aplicações multicoloridas e imagens de corpo inteiro.

2.  TurboFPs

Proteínas superbrilhantesde diferentes cores recomendadas para aplicações que requerem um rápido aparecimento de fluorescência brilhante, incluindo a marcação de células e organelas ou a atividade do promotor de seguimento.        

• TurboGFP: Proteína verde brilhante, variante melhorada da proteína verde fluorescente CopGFP clonada a partir do copépode Pontellina plumata [Shagin et al., 2004]. Recomendado para aplicações onde o aparecimento rápido de cor fluorescente é necessário, para expressão gênica, marcação de células e organelas, e monitoramento da atividade do promotor.
• TurboYFP: Proteína amarela-verdadeira brilhante, é uma variante melhorada da proteína fluorescente amarela PhiYFP da água-viva Phialidium sp. [Shagin ET a., 2004]. Recomendado para aplicações onde o aparecimento rápido de cor fluorescente é necessário, para expressão gênica, marcação de células e organelas, e monitoramento da atividade do promotor. Seu comprimento de onda de emissão é idealmente localizado entre as proteínas fluorescentes verde e vermelha, o que permite separar facilmente, por citometria de fluxo, esses marcadores, utilizando canais de detecção comuns e uma única linha de excitação a laser.
• TurboRFP: Proteína vermelha (laranja) fluorescente brilhante derivada da anêmona marinha Entacmaea quadricolor [Merzlyak et al., 2007]. Apresenta ótima fotoestabilidade e pH estável. Recomendado para aplicações onde o aparecimento rápido de cor fluorescente é necessário, para expressão gênica, marcação de células e organelas, e monitoramento da atividade do promotor.
• TurboFP602: Proteína vermelha-verdadeira fluorescente brilhante, variante da TurboRFP, mas com a banda de fluorescência até o vermelho, permitindo seu uso em amostras com fluorescência endógena. Sua faixa de emissão é ideal para detecção através dos filtros mais comuns e é facilmente distinguida dos sinais de fundo. Recomendado para aplicações onde o aparecimento rápido de cor fluorescente é necessário, para expressão gênica, marcação de células e organelas, e monitoramento da atividade do promotor.
• TurboFP635: Proteína vermelha distante fluorescente brilhante, mutante vermelho distante da proteína fluorescente vermelha da anêmona do mar Entacmaea quadricolor [Shcherbo et al., 2007]. Recomendada para a marcação de células e organelas em ambientes autofluorescentes, aplicações multicoloridas e imagens de todo o corpo.

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3.  Proteínas fluorescentes para obter imagens e detalhes de todo o organismo

A obtenção de imagens de tecidos profundos usando proteínas fluorescentes permite a observação direta e não invasiva dos processos biológicos dentro de organismos vivos. A principal dificuldade das imagens fluorescentes em animais inteiros é a absorção de luz pela melanina e hemoglobina, bem como a dispersão da luz. Tanto a absorção como a dispersão se tornam menos pronunciadas à medida que o comprimento de onda da luz aumenta. A "janela óptica" ideal, que é mais transparente para visualização em tecidos vivos, é considerada entre 650-700 e 1100 nm. Portanto, o uso de proteínas fluorescentes vermelho distante ou infravermelho próximo aumenta drasticamente a sensibilidade das imagens do corpo inteiro em comparação com os FP convencionais. Evrogen oferece vetores de expressão que codificam proteínas fluorescentes infravermelhas distantes e infravermelhas perfeitamente adequadas para tal aplicação.

• Katushka2S: Proteína super vermelho distante fluorecente, é a próxima geração do TurboFP635, com melhores propriedades ópticas
• TurboFP650: Proteína infravermelha-próxima fluorescente. Também é um variante de TurboFP635, com uma fotoestabilidade elevada. Sua principal característica é o grande deslocamento de batocromo entre o comprimento de onda de excitação de 592 nm e a emissão máxima que tem a 650 nm. Esta é a proteína fluorescente mais brilhante que podemos encontrar com uma emissão máxima superior a 635 nm. É recomendado para uso em aplicações multicoloridas.
• NirFP: Proteína infravermelha-próxima fluorescente com a banda de emissão máxima a 670 nm. Sua estabilidade não é afetada por alterações de pH, o que o torna um bom candidato para experimentos onde o acúmulo do sinal fluorescente é necessário durante longos períodos de exposição. Além disso, permite o uso de lasers de alto comprimento de onda para a excitação (633 ou 635 nm), que causam menos danos às células do que quando irradiados com lasers de maior energia.