Nove reagentes para laboratório e suas aplicações em pesquisas

Reagentes químicos

Os reagentes químicos que são usados em pesquisa vão desde moléculas muito pequenas e fáceis de se obter até outras muito complexas e mais complicadas de serem obtidas.

Neste artigo, descreveremos as aplicações de nove reagentes químicos comercializados pela empresa Wako, fabricante e distribuidora de reagentes para laboratórios.

Agosterol A

Em 1998, um esteróide polihidroxilado de uma esponja marinha (Spongia sp.) foi isolado, que ficou conhecido como Agosterol A. Desde que sua caracterização ocorreu, os pesquisadores constataram que ele revertia a resistência aos medicamentos nos pacientes com câncer que são submtetidos à quimioterapia. A resistência à terapia com medicamentos anticancerígenos ocorre pela superexpressão da chamada proteína 1 humana (multidrug resistance protein 1 (MRP1)), em células onde a resistência não está mediada pela glicoproteína-P. Desde que este composto começou a ser comercializado foram feitas varias pesquisas para estudar seu efeito na terapia anticancerígena. Estudou-se, por exemplo, seu efeito na terapia com medicamentos anticancerígenos, como a vincristina e a colchicina, aonde se diminui a resistência aos medicamentos, inibindo diretamente o fluxo de medicamentos para a glicoproteína-P e/ou MRP1.

O mesmo grupo de pesquisadores que isolou o Agosterol A demonstrou com o uso desta molécula, qual era o local de ancoragem da glutationa à MRP1, já que se sabia de antemão que a resistência aos medicamentos dependia da concentração da glutationa no meio, mas ainda não se havia esclarecido o mecanismo.

Superóxido Dismutase (Tipo Mn)

A enzima superóxido dismutase de manganês (MnSOD), deve seu nome à catalisação da reação de dismutação dos ânions superóxidos em nível celular, e se diferencia de outras enzimas desta família porque necessita como co-fator para exercer sua função ao cátion de manganês. Os pesquisadores da Wako chegaram à conclusão que embora a MnSOD possa ter atividade mesmo antes de sua localização na mitocondria, esta é necessária para atingir a resistência ao stress oxidativo.

Quando a MnSOD é transportada para a mitocondria, ela permite que a células captem as moléculas que contêm oxigênio reagente, geradas no interior e no exterior da mesma. Esta enzima está associada à defesa dos organismos contra os processos de oxidação, e por isso é amplamente utilizada na pesquisa de doenças associadas à presença de espécies oxidantes. Utiliza-se para investigar a obesidade e como biomarcador dos procesos oxidativos e inflamatórios.

Esta molécula também tem sido útil para estudar o mecanismo de ação de outros medicamentos no corpo humano. Um exemplo é o estudo desenvolvido com a rapamicina, medicamento imunosupressor usado em pacientes transplantados, com câncer e em processos relacionados com o envelhecimento. Tinha-se conhecimento que nas células normais o efeito protetor da proteína captadora deste medicamento em mamíferos era mediado pelo aumento na expressão de MnSOD, mas não em células cancerígenas. O objetivo deste estudo é aproveitar a diferença de comportamento do medicamento frente às células cancerígenas, para alcançar a proteção destas últimas.

Anticorpo monoclonal Anti-AGO2 humana

O anticorpo monoclonal contra a proteína Argonauta2 humana foi desenvolvido pela Wako, principalmente para o uso em pesquisas relacionadas com moléculas de microRNA. Uma das etapas-chave para a formação de algumas das moléculas de microRNA (proteínas de cadeia curta muito importantes na regulação da expressão genética) é controlada pela proteína Argonauta2, ribonuclease localizada nos corpos P do citoplasma. Para a determinação das funções do microRNA se utiliza um complexo formado por estas moléculas com as proteínas do tipo Argonauta. Este anticorpo monoclonal pode ser usado para a precipitação da proteína Argonauta2 humana, mediante a técnica de imunoprecipitação, usando como método de visualização com coloração de prata ou o Western Blot.

O anticorpo monoclonal contra a proteína Argonauta2 humana permitiu desenvolver estudos para compreender o papel que o RNA possui na regulação da indução de células-tronco pluripotentes, observando-se se os níveis de microRNA na célula estão diretamente relacionados com a eficiência na indução das células-tronco e também sua função no processo de reprogramação celular. Além disso, conseguiu-se a descrição dos locais de união da proteína Argonauta2 em células-tronco embrionárias em ratos. Outros pesquisadores também descreveram a relação entre as proteínas do tipo Argonauta presentes nos humanos e sua relação com diversos tipos de RNA, incluindo as cadeias que não são de microRNA, para isso foi necessário fazer uso deste anticorpo e de outros que se unem especificamente a outras proteínas da familia.

3-(1-Anilino etilideno)-5-bencilpirrolidina-2,4-diona

Este reagente é comercializado pela Wako com o nome de TN-16 e é utilizado como agente de sincronização celular.

Ele possibilita o estabelecimento de ciclos nos cultivos celulares, que é utilizado no estudo de mecanismos de proliferação celular de células hospedeiras. Sua aplicação se estende aos campos de transformação genética, o estudo de vírus, de ácidos nucleicos e de câncer. Ao inibir a divisão celular, ele é utilizado para conseguir o acúmulo de células durante a fase mitótica nos cultivos sincronizados.

A vantagem que ele apresenta em relação a outros sincronizadores celulares convencionais é o restabelecimento da divisão celular com maior facilidade, uma vez que lavada para eliminar o reagente do meio.

Bialaphos

A Wako comercializa o sal de sódio de Bialaphos, um antibiótico produzido pela actinobactéria do gênero Streptomyces. Esta molécula é um peptídeo formado por dois resíduos de alanina unidos a um glufosinato, molécula análoga ao ácido glutâmico. O Bialaphos age como inibidor da glutamina sintetase, enzima que participa do metabolismo do nitrogênio, catalisando a reação mediante a qual um nitrogênio proveniente do amoníaco se junta à molécula de glutamato, dando lugar à glutamina. Este reagente é ativado quando ele é atacado pelas peptidases, que quebram o vínculo das alaninas com o glufosinato que é a molécula ativa. A toxicidade do glufosinato se deve à inibição da glutamina sintetase, que faz com que se acumule o amoníaco nas células, por conseguinte, esta molécula é comercializada como herbicida não seletivo.

O Bialaphos é utilizado em pesquisas, tanto por ter propriedades antibióticas, como por ser precursor do glufosinato. Além disso, se descobriu que alguns microrganismos são capazes de acetilar o grupo amino do Bialaphos e do glufosinato, o gene que modifica a enzima que catalisa esta reação foi isolado e é utilizado em estudos de resistência de plantas em relação a este herbicida. Também se estudou leveduras modificadas que apresentam uma alta resistência ao Bialaphos; células que servem para diversos estudos.

Estreptolisina O, recombinante

A estreptolisina O é uma potente toxina citolítica que é produzida por quase todos os microrganismos da família dos estreptococos A e alguns dos grupos C e G. A produção desta toxina pelos estreptococos do grupo A está associada a doenças muito comuns como faringite ou impetigo e pode ser muito perigosa pela capacidade destas bactérias penetrarem nas células epiteliais, causando infecções generalizadas e interação dos estreptococos com as células epiteliais.

Apesar das doenças que esta toxina causa no corpo humano, têm sido feitas pesquisas a respeito dos diferentes papéis dos domínios desta proteína para conseguir se chegar a análogos mutantes e desenvolver vacinas para uso humano. Ela é um agente anticancerígeno em potencial, que tem sido utilizada para a obtenção de genes que possam ser introduzidos nos tumores para matar as células cancerígenas, uma técnica conhecida como terapia do gene suicida. Além disso, é utilizada no estudo de liberação de medicamentos, porque é capaz de unir moléculas carregadas e liberá-las em diferentes meios. Esta molécula é objeto de várias pesquisas atuais para se compreender os mecanismos de ataque em que está implicada e, por outro lado, aproveitar sua toxicidade para eliminar células cancerígenas.

Acrilamida Phostag

A acrilamida Phos-tag™ é utilizada para se detectar substâncias fosforiladas, já que reconhece os grupos monoésteres de fosfato. Phos-tag™ é uma molécula funcional que se une especificamente aos ânions fosforilados, e ligada à acrilamida, permite a separação de proteínas fosforiladas. Pode ser utilizada in vitro em ensaios de detecção de quinases. Na análise da fosforilação de proteínas endógenas em células e tecidos animais, com a vantagem de que não se necessita de marcação isotópica para realizar estes procedimentos.

Ela funciona com o principio da SDS-PAGE (eletroforese em gel de poliacrilamida com dodecil sulfato sódico), que é a técnica mais utilizada para separar proteínas. Adiciona-se, junto ao cloreto de maganês, quando o gel SDS-PAGE já está preparado. Durante o processo de migração, as proteínas fosforiladas se juntam aos metais divalentes presentes na molécula de Phos-tag™. Ao se efetuar a união, a velocidade de migração das proteínas fosforiladas com relação às não fosforiladas diminui, separando-se umas das outras.

Mediante o uso deste reagente, se chega ao reconhecimento de todas as formas fosforiladas de serina, treonina e tirosina. Depois das proteínas estarem separadas, o gel da eletroforese pode ser utilizado para a análise de Western blot ou análise de Espectrometria de Masa (EM).

Este reagente de laboratório tem sido aplicado em estudos de migração por eletroforese em duas dimensões, para a análise de formas fosforiladas da hnRNPK em que se pode distinguir cada uma das fosforiladas com o mesmo ponto isoelétrico. Também se conseguiu, por exemplo, a determinação da atividade quinase em cada uma das frações da proteína GST-Dnmt1 obtida do cérebro de ratos. Para isso, para cada uma das frações eluídas de uma coluna de celulose, foi realizado um ensaio de quinase in vitro e a atividade quinase foi determinada por ensaio de Western blot usando Phos-tag™ SDS-PAGE.

4,2',4'-Trihidroxichalcona

A 4,2’,4'-trihidroxichalcona também chamada isoliquiritigenina, é uma chalcona natural extraída, neste caso, das raízes de alcaçuz. Este produto vem da medicina tradicional chinesa e tem sido objeto de várias pesquisas devido ao seu efeito antitumoral. Além disso, apresenta propriedades farmacológicas como antialérgico, antioxidante e anti-inflamatório. Foi comprovado que a atividade antitumoral da isoliquiritigenina é muito diversificada. Inclui, por exemplo, a indução da apoptose em células cancerígenas humanas gástricas e a inibição de câncer de mama e de cólon em ratos. Também atua como medicamento para prevenir o câncer mediante a indução de enzimas de fase II que protegem as células contra espécies reagentes, tóxicas, ou potencialmente cancerígenas.

Como consequência de seu metabolismo no corpo humano pode apresentar uma interação com outros medicamentos e tem-se especulado que inibe a ação da enzima UDP-glucuronosiltransferase que possibilita a degradação de moléculas lipídicas, entre elas,alguns medicamentos em metabólitos excretáveis. Descobriu-se também que seu efeito hipnótico é exercido por modulação alostérica positiva dos receptores de ácido-aminobutírico do tipo A, especificamente os receptores GABA(A)-benzodiazepina. Por todas as suas possibilidades como medicamento e suas possíveis interações com outras moléculas bioativas, é um reagente de grande importância na pesquisa.

NCDM-32b

O NCDM-32b, é um reagente inibidor da histona deacetilase pertencente ao domínio de Jumonji 2 (JMJD2C). As histonas são enzimas que participam nos processos de crescimento, no desenvolvimento e na diferenciação de embriões e na regulação da expressão genética. O gene JMJD2C está associado com o desenvolvimento de diferentes tipos de carcinomas em seres humanos, e por isso, os inibidores de JMJD2C são candidatos a serem agentes anticancerígenos e uma ferramenta muito potente para explicar o mecanismo de ação destes genes. Com este reagente, foram desenvolvidas pesquisas relacionadas com o carcinoma de esôfago, câncer de cólon e leucemia.

Os inibidores de JMJD2C também podem alterar a função de outros fatores transcripcionais e ter efeitos nas proteínas de histonas, o que aumenta o interesse por este reagente para a pesquisa. O NCDM-32b é comercializado exclusivamente pela Wako.

OUTROS REAGENTES PARA LABORATÓRIO

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