8 reagentes laboratoriais para a análise de proteínas

A análise de proteínas pode ser considerada como algo rotineiro em um laboratório de biologia, assim como um fator-chave em uma pesquisa. A estrutura química proteica está presente nas enzimas, receptores e em muitas outras biomoléculas. De acordo com a forma que os aminoácidos que constituem uma proteína estão ordenados, esta terá algumas propriedades físico-químicas que a caracteriza.

A importância das proteínas que formam parte dos sistemas biológicos é indubitável. Basta mencionar, por exemplo, que a espécie humana não existiria sem a contribuição destas substâncias, já que alguns aminoácidos necessários para a vida se incorporam em humanos através das proteínas que consumimos em nossa dieta, pois nosso organismo é incapaz de sintetizá-las.

Entre os métodos de análise mais usados para a análise de proteínas estão os de separação: a eletroforese em gel de acrilamida com dodecil sulfato de sódio, que se conhece por seu acrônimo SDS-PAGE (SDS-poliacrilamida gel eletroforese) onde se separam as proteínas por tamanho, a cromatografía líquida de alta resolução (HPLC) e o Western Blotting. Para a identificação das proteínas se usa frequentemente a Espectrometria de Massas, a Ressonância Magnética Nuclear (RMN) e a degradação de Edman.

Neste artigo se comenta a utilidade de alguns reagentes de laboratório utilizados na análise de proteínas nos laboratórios de biologia dedicados à investigação científica.

1. 5-carboxifluoresceína [5-FAM]

A 5-carboxifluoresceína é um indicador fluorescente que permite a marcação de proteínas in situ. Uma vez que a proteína é marcada com o colorante orgânico análises espectroscópicas podem ser desenvolvidas, assim como cromogênicas e fluorogênicas com a molécula, assim como utilizar a marcação para visualizar a espécie mediante microscopia.

2. Marcadores de peso molecular para usar em eletroforese com tingimento prata

Para a eletroforese de proteínas, pode-se utilizar os marcadores de peso molecular, que permitem um tingimento uniforme das proteínas segundo seu peso. Neste caso, são utilizados marcadores para a SDS-PAGE quando é selecionado um método de tingimento com prata. Os marcadores fazem com que a banda correspondente a cada proteína seja reduzida, melhorando a detecção.

A Wako dispões de 4 tipos de marcadores de peso molecular que cobrem toda a categoria de pesos onde estão as proteínas analisadas no laboratório:

• baixo peso 6.5 – 42 kDa
• médio peso 14 – 79 kDa
• alto peso 16 – 180 kDa
• amplo peso 6.5 – 180 kDa

3. Acrilamida Phos-tag™

O sistema Phos-tagTM está programado para a análise de proteínas fosforiladas. A Acrilamida Phos-tag™ é adicionada quando se está preparando o gel da SDS-PAGE para separar as proteínas fosforiladas. A velocidade de migração no gel das proteínas fosforiladas diminui ao estar atada pela acrilamida Phos-tag™, permitindo a separação das proteínas não fosforiladas. Este reagente permite inclusive a separação de isoformas fosforiladas em diferentes posições, podendo se reconhecer todas as formas fosforiladas de serina, treoninas e tirosina. As amostras que contêm Acrilamida Phos-tag™ podem ser usadas para estudos por Espectrometria de Massas e Western Blot.

A série Phos-tag™ além disso, inclui reagentes, como:

• Biotina Phos-tag™ (para a detecção específica, sem usar anticorpos anti-fosforilados em Western Blot).
• Agarose Phos-tag™ (para o enriquecimento, separação e purificação de proteínas fosforiladas usando colunas cromatográficas).

4. Buffers para eletroforese com 2-mercaptoetanol

Laemmli Buffers com 2-mercaptoetanol: dois buffers onde varia a relação entre os componentes: TRIS-HCl, glicerol, BPB e o 2-mercaptoetanol.

A Wako também distribui Buffers de Laemmli sem 2-mercaptoetanol e com 2-mercapto-1,3-propanodiol, um substituto do 2-mercaptoetanol com menor toxicidade.

5. Série de membranas hidrofóbicas ClearTransTM para Western Blot

ClearTrans™ é a marca com que a Wako comercializa membranas hidrofóbicas para a análise de proteínas pelo método de Western Blot:

• Membrana de (poli) fluoreto de vinilideno (PVDF) ClearTransTM. (Estas membranas podem ser usadas para a detecção por fluorescência de proteínas, por sua alta afinidade com as proteínas. Neste caso se tratam de membranas com poros de diâmetro de 0.2 μm que reduzem a permeabilidade às proteínas de baixo peso molecular).
• Membrana de nitrocelulose ClearTrans™ (A membrana de nitrocelulose pode ser usada para transcrições).
• Membrana de Nylon ClearTrans™ (Membrana de nylon não carregada para análise de Western Blot).

6. Reagentes ImmunoStar™

Com os reagentes da marca ImmunoStar pode-se fazer a detecção de proteínas mediante métodos colorimétricos, em picogramas. Além de medir a luminescência, pode-se realizar medidas de cor e em UV. O uso de reagentes ImmunoStar permite obter medidas com uma alta relação sinal/ruído. A Wako dispõe de reagentes formados por três componentes que melhoram a qualidade das medidas. A série ImmunoStar™ tem, além disso, reagentes de dois componentes (o ImmunoStar™ LD de grande sensibilidade e o ImmunoStar™ Zeta que apresenta um sinal luminescente estável no decorrer do tempo).

7. Lisil endopeptidase com pureza para MS

A lisil endopeptidase, assim como a tripsina, são usadas como enzimas de digestão para a análise proteômica. Uma vez realizada a digestão das proteínas, os peptídeos obtidos pela Espectrometria de Massa são estudados, podendo desta forma se identificar a proteína. A lisil endopeptidase é vendida em pequenas porções em forma de sólido liofilizado.

8. Di-4-ANEPPS

O reagente comercializado como Di-4-ANEPPS é o sal de 4- {2-[6- (dibutilamino) -2-naftalenil]etenill} -1- (3-sulfopropil) -hidroxi piridinio. Este composto fluorescente possui uma longitude de onda de excitação de 496 nm e de emissão de 705 nm. Este sal é um corante do tipo esterílico e se usa como prova molecular em técnicas de microscopia, por exemplo, para estudos do cérebro, entre muitas outras aplicações.

REAGENTES PARA LABORATÓRIO:

Matriz celular do tipo I-A	GoldMAN™	Kit Target mRNA Cloning da Wako