5 reagentes para o estudo das funções do Micro-ARN

São conhecidas como micro-ARN pequenas cadeias de ARN compostas por uma média de 23 nucleótidos que participam na regulação da expressão dos genes através da união ao ARN mensageiro.

Os micro-ARN expressam-se em grande quantidade de genes dos organismos dos diferentes reinos, em alguns casos até já se detetou serem cadeias muito antigas que permaneceram intactas ao longo da evolução, pelo que exercem uma grande influência no desenvolvimento. Alguns estudos demonstram que existe micro-ARN que apenas afeta o desenvolvimento do tecido onde se expressa, enquanto que outros podem ser determinantes no desenvolvimento do embrião como tal e dos diferentes sistemas orgânicos.

Ao serem capazes de regular a expressão génica, os micro-ARN podem ter um papel fundamental no cancro. As investigações a respeito deste tema têm revelado que, em muitos casos de cancro, a expressão dos micro-ARN encontra-se modificada. Os cientistas, atualmente, estudam os mecanismos que conduzem a que os micro-ARN modulem genes implicados na formação de tumores, e também que os suprimam. As investigações com tumores humanos mostram que o perfil de expressão do micro-ARN difere dos tecidos normais para aqueles tecidos tumorais, havendo também diferenças para cada tipo de tumor.

A empresa Wako comercializa uma série de reagentes para o uso em investigações relacionadas com o micro-ARN. Neste artigo avalia-se a qualidade de 5 destes reagentes.

1. Anticorpo monoclonal anti-Ago1 humano e de rato

Este anticorpo pode ser utilizado para a purificação de micro-ARN unido à proteína Ago1, mediante a técnica de imunoprecipitação. Considera-se que os micro-ARN, ao incorporarem-se nas proteínas do complexo RISC (complexo silenciador induzido pelo ARN), são capazes de degradar as cadeias de ARN mensageiro ou de inibir a sua tradução. As principais componentes do complexo RISC são as proteínas da subfamília designada Argonautas, Ago1 e Ago2. Após se unir as proteínas Ago1 e Ago2, os micro-ARN acoplam-se aos ARN mensageiros. Ao precipitarem-se os complexos RISC com o anticorpo monoclonal anti-Ago1, podem-se recuperar os micro-ARN unidos a este complexo e trabalhar com estas moléculas em investigações específicas.

As investigações em que se decidem utilizar estes anticorpos são bastante diversas, por exemplo quando se estuda um ARN mensageiro em particular ou para estudos de clonagem celular. Em biomedicina são muitos os temas que se abordam da perspetiva do papel das moléculas de micro-ARN que se relacionam com uma determinada patologia e pode também ser útil contar com o anticorpo monoclonal anti-Ago1 que tem reatividade cruzada tanto com a proteína Ago1 humana como com a de rato.

2. Anticorpo Monoclonal Anti-PIWIL1

As proteínas PIWI são outra subfamília da família de proteínas Argonauta. O domínio PIWI das proteínas Argonauta está presente em células germinativas, em todas as eucarióticas, pelo que desempenha um papel fundamental em todas as investigações relacionadas com as funções do micro-ARN, a sua união às proteínas Argonauta e a regulação génica. A subfamília de proteínas PIWI também se expressa noutros tipos de células-mãe e, em humanos, é constituída por PIWIL1 (também designada HIWI), PIWIL2 ou HILI, PIWIL3, PIWIL4 ou HIWI2. Em ratos as PIWI1, 2 e 4 são chamadas MIWI, MILI e MIWI2, respetivamente. O ARN que interage com o domínio PIWI é conhecido como piARN e tem um papel importante na regulação da diferenciação celular e no desenvolvimento. O piARN é formado por cadeias de maior número de nucleótidos do que o micro-ARN.

O anticorpo monoclonal 2C12 é utilizado para a imunoprecipitação de HIWI (PIWIL1 humana) e MIWI (PIWIL1 de rato). Além disso, pode ser utilizado na purificação de piARN.

3. Kit de isolamento de micro-ARN unido à proteína Ago2 humana (microRNA Isolation Kit, Human Ago2)

O micro-ARN unido à proteína Ago2 humana pode obter-se por imunoprecipitação a partir de cultivos celulares utilizando o anticorpo monoclonal específico para a proteína Ago2 humana. Esta proteína é a chave no papel dos micro-ARN, uma vez que é esta proteína que ativa a cisão de cadeias do ARN mensageiro alvo.

Este kit está desenhado de maneira a que o precipitado de proteínas obtido pela técnica de imunoprecipitação seja lavado e, posteriormente, seja tratado como uma solução que faz parte do kit capaz de dissolver a proteína Ago2. Desta maneira pode-se obter micro-ARN com um grau de pureza suficiente para ser utilizado diretamente noutras técnicas que ajudam à compreensão dos sítios de união do complexo RISC, os mecanismos de replicação dos vírus patogénicos mediante a análise genómica e muitos outros processos que estão regulados pelo micro-ARN através da sua união aos ARN mensageiros correspondentes. O kit de isolamento de micro-ARN unido à proteína Ago2 humana foi utilizado, com êxito, para obter micro-ARN a partir de amostras de sangue: desde a descoberta de micro-ARN no plasma sanguíneo, foram desenvolvidos numerosos estudos para o uso destas moléculas como biomarcadores de patologias comuns como o cancro.

4. Enoxacina V1

A enoxacina V1 é o composto amida N-terbutil-1-etil-7-(1-piperazinil)-6-fluoro-1,4-dihidro-4-oxo-1,8-naftiridina-3-carboxílica. Esta amida é um análogo sintético da enoxacina que é um antibiótico do tipo das fluoroquinolonas. Comprovou-se que a enoxacina é capaz de aumentar a produção de micro-ARN que atua na supressão tumoral. O mecanismo de ação da enoxacina baseia-se na ligação à proteína TAR (proteína de união ao ARN) que participa na biossíntese do micro-ARN. Assim sendo, podem-se encontrar tratamentos anti-tumorais através da restauração dos níveis basais de micro-ARN.

Com a enoxacina V1 e outros derivados da enoxacina que a Wako comercializa podem-se conduzir investigações da inibição do crescimento dos diferentes tipos de tumores estudando, em cada caso, a influência destas moléculas no processamento do micro-ARN e observando as consequências no desenvolvimento dos tumores e no restabelecimento dos níveis normais de micro-ARN.

5. Kit de clonagem de micro-ARN (MicroRNA Cloning Kit Wako)

Em algumas das investigações com o micro-ARN torna-se necessário dispor de uma maior quantidade de amostra do que a isolada de um material biológico em específico. Nestes casos pode-se utilizar o kit de clonagem de micro-ARN da Wako com o qual, a partir de uma pequena fração de micro-ARN, pode-se reproduzir esta cadeia, ao obter um clone do ADN que a codifica. O kit da Wako utiliza a fosfatase alcalina de camarão que permite que se obtenha uma maior eficiência no processo de clonagem comparado com outros kits que se podem encontrar no mercado. Este kit de clonagem de micro-ARN permite preparar ADN clonado que codifica para micro-ARN no espaço de tempo de um dia e meio.

REAGENTES PARA LABORATÓRIO PARA O ESTUDO DO MICRO-RNA

Anticorpo monoclonal anti - α - sinucleína fosforilada	Anticorpo monoclonal anti P2X4	Anticorpo monoclonal anti-AGO2 humana