16 anticorpos monoclonais e suas aplicações

O que são anticorpos monoclonais? Um anticorpo monoclonal é aquele que se obtém a partir da multiplicação de uma única célula-tronco, mediante técnicas que permitem isolar as moléculas dum linfócito diferenciado e que são produzidas contra um antigénio específico.

Sabendo que se chama anticorpo às glicoproteínas sintetizadas pelos linfócitos B, que defendem o organismo contra agentes patogénicos desencadeando respostas distintas à presença de estes agentes designados antigénios, pode-se afirmar que os monoclonais cumprem esta função sendo, contudo, obtidos em laboratório por técnicas clonais como a diluição limitante.

No organismo podem ser encontrados fixos ao parênquima celular ou solúveis no plasma sanguíneo e todos apresentam uma estrutura formada por cadeias pesadas e leves com dois locais de ligação para o antigénio. Podem obter-se com recurso à técnica do hibridoma (a mais comum e a única utilizada a princípio) ou por técnicas de engenharia genética (hibridização génica e vectores de clonagem).

Os anticorpos monoclonais classificam-se em murinos, quiméricos, humanizados e humanos segundo o tipo de cadeias que compõem a estrutura do anticorpo. Os primeiros anticorpos monoclonais obtinham-se a partir da fusão duma linha celular de mieloma murino com células imunitárias, constituindo os chamados murinos. Com o início da utilização dos anticorpos para fins terapêuticos no humano, como para tratar linfoma, surgiram problemas de compatibilidade pois havia produção de anticorpos humanos anti-murinos. Com isto começaram-se a substituir algumas regiões das cadeias dos anticorpos por cadeias humanas para constituírem os anticorpos quiméricos (o local de reconhecimento do antigénio não é humano, mas o resto do anticorpo sim) e humanizados (a única porção murina é parte integrante das cadeias variáveis). Outra técnica comum actualmente é a utilização de animais transgénicos que, ao transportarem genes humanos, podem produzir anticorpos humanos específicos a determinado antigénio para estimular a expansão clonal e obterem-se então os anticorpos monoclonais humanos pretendidos.

A função na Medicina

Os anticorpos monoclonais utilizam-se tanto no tratamento de diversas doenças como no diagnóstico de muitas outras. Desde a descoberta dos anticorpos monoclonais, começaram a ser utilizados em ensaios de histocompatibilidade e para distinguir células tumorais de não tumorais. Na maioria dos métodos imunológicos utilizados no diagnóstico actual de doenças, os anticorpos monoclonais estão presentes em testes de identificação de agentes patogénicos como na técnica ELISA, a detecção de doenças com recurso à citometria de fluxo que utiliza estes anticorpos unidos a moléculas fluorescentes, e entre outros ensaios imunohistoquímicos já habituais em qualquer laboratório clínico. Com o uso destes anticorpos, já podem ser quantificados os biomarcadores associados à trombose e à extensão das reacções alérgicas do organismo e, no futuro, poderá vir a constituir uma ferramenta chave para o desenvolvimento de terapias personalizadas.

Para o desenvolvimento de fármacos também foram utilizados anticorpos monoclonais, em técnicas de purificação fundamentalmente de interferões e na procura de alvos terapêuticos. Mais recentemente começaram a ser produzidos fármacos conjugados com anticorpos que permitem uma maior especificidade e eficácia que os tratamentos convencionais.

No que respeita ao tratamento de doenças, cada dia são aprovados mais anticorpos monoclonais que passaram as fases de ensaios clínicos correspondentes e estão aptos a serem utilizados em humanos. O seu uso principal foca-se no tratamento de alguns tipos de câncer, nomeadamente o cancro da mama, do cólon e linfomas, doenças imunológicas, inflamações crónicas como a artrite reumatóide e para evitar a rejeição de órgãos transplantados.

Os anticorpos monoclonais foram utilizados como anticancerígenos constituindo diversas técnicas conjuntamente com radionucleótidos, o que no início era conhecido por radioimunoterapia – esta definição é utilizada actualmente para se referir a outros métodos que combinam a imunoterapia com a radioterapia. Como fármacos por si só, ou conjugados com outros medicamentos, a sua eficácia foi também demonstrada, conseguindo uma maior especificidade na acção do medicamento. Os alvos terapêuticos dos anticorpos que visam combater o cancro podem ser os receptores dos factores de crescimento ou os próprios factores de crescimento que, ao unirem-se ao anticorpo são inactivados. Os antigénios da superfície celular ou a união à célula clonal provocam uma resposta do sistema imunitário que também induz a apoptose.

Para o tratamento de doenças autoimunes foram utilizados anticorpos contra o factor de necrose tumoral alfa, a integrina α4β1 e proteínas de superfície. De entre as doenças que podem ser combatidas com anticorpos monoclonais encontra-se a artrite reumatóide. Comprovou-se que a terapia com anticorpos anti-factor de necrose tumural alfa é mais eficaz que os fármacos convencionais, apesar do risco de predisposição a determinadas infecções.

Para o tratamento da esclerose múltipla, a terapia com anticorpos comprovou ser capaz de melhorar a qualidade de vida dos pacientes e, apesar de ainda faltar percorrer um longo caminho para eliminar os efeitos secundários e tornar a acção dos anticorpos mais específica, crê-se que se tornará a terapia de eleição no futuro.

A doença de Crohn’s, uma doença inflamatória intestinal que pode causar sintomas muito variados e para a qual ainda não se conhece uma cura, é tratada desde há alguns anos com anticorpos monoclonais como o Infliximab que inibe o factor de necrose tumoral alfa ao unir-se a ele. Este fármaco já possui estudos de tratamento de longo prazo e, apesar de se ter verificado que a sua utilização não é necessária em todos os pacientes que padecem desta doença e que pode ter vários efeitos secundários, há um grupo de pacientes no qual a terapia é muito eficaz. Recentemente documentou-se que outro anticorpo monoclonal, o Ustekinumab, que actua por inibição das interleucinas 12 e 23, foi crucial para remitir os sintomas da psoríase do couro cabeludo numa paciente com doença de Crohn’s, contribuindo também para a melhoria dos sintomas da última.

A asma também pode ser tratada com um anticorpo anti-imunoglobulina E pois, esta doença, resulta da acumulação da molécula IgE segregada em resposta a agentes alergénicos a que o indivíduo se expõe. Por exemplo, o Omalizumab é um fármaco que tem vindo a ser utilizado por pacientes com asma moderada a severa. O tratamento com este anticorpo reduz as possibilidades de exacerbação da doença, tanto que é observável a melhoria em pacientes que são também tratados com corticosteróides, a terapia mais associada à mortalidade provocada pela asma. Mais recentemente também se descreveu as vantagens que o uso de Dupilumab oferece, um anticorpo monoclonal anti-interleucinas 4 e 13, ambas citocinas envolvidas no percurso fisiológico das patologias alérgicas.

No caso do lúpus eritematoso sistémico e na artrite psoriática, ainda que se tenham realizado ensaios clínicos, as terapias continuam a ser ou pouco eficazes ou têm demasiados efeitos secundários. Actualmente, levam-se a cabo estudos para definir contra que tipo de alvo terapêutico é mais aconselhável o uso dos anticorpos monoclonais.

Os anticorpos monoclonais também são usados para tratar sintomas relacionados com doenças cardiovasculares como a arritmia cardíaca mais frequente (a fibrilação auricular) e as infecções que podem afectar pacientes com doenças coronárias graves como o vírus sincicial respiratório humano. Embora muitas das reacções adversas do uso terapêutico de anticorpos monoclonais estejam relacionadas com quadros cardiovasculares, a cada dia que passa, documentam-se mais investigações sobre o uso destes anticorpos para o tratamento de patologias como a hipercolesterolemia. Se bem que muitos sejam estudos pré-clínicos que sugerem que os anticorpos são bem tolerados em pacientes com doenças cardiovasculares e que podem vir a apresentar um grande potencial de terapia biológica futura.

Alguns dos anticorpos monoclonais comercializados pela Wako para investigação médica descrever-se-ão de seguida:

1. Anticorpo monoclonal Anti-AGO2 humana

Anticorpo monoclonal anti-AGO2 humana pode ser usado para a imunoprecipitação da proteína Argonauta2 (AGO2) humana, além do seu uso em imunoeletroforese (Western Blot) e análise imuno-histoquímica.

A proteína Argonauta2 forma parte do complexo silenciador induzido pelo ARN, conhecido como RISC (da sigla em inglês: RNA – induced silencing complex). A AGO2 participa na síntese de moléculas de micro-ARN, catalisa a sua adesão ao complexo RISC e está envolvida em diversos processos relacionados tanto com o micro-ARN como com outros tipos de ARN.

Este anticorpo pode ser útil em investigações relacionadas com o vírus da imunodeficiência adquirida humana assim como outros trabalhos laboratoriais que envolvam a utilização de células progenitoras.

2. Anticorpo monoclonal Anti-ASK1

A proteína ASK1 (proteína cinase reguladora do sinal apoptótico 1) tem um papel fundamental na apoptose induzida por stress. A cascata de proteínas cinases activadas por mitógenos MAPK (do inglês, Mitogen-Activated Protein Kinase) é uma forma de resposta intracelular dos organismos a diversos estímulos extracelulares. Existem diferentes componentes nestas vias de sinalização, podendo-se encontrar as MAPK cinase cinase que são activadas ou ao interactuar com uma proteína G ou por fosforilação. Isto conduz à activação de uma MAPK cinase que, por sua vez, activa a MAPK. A MAPKK ou MAPK cinase cinase é uma família de cinases entre as quais se encontra a cinase reguladora da apoptose conhecida como ASK1. Este anticorpo pode ser usado em estudos relacionados com as causas que provocam a sobre-expressão da proteína ASK1.

3. Anticorpo monoclonal Anti-ASK1 fosforilada

O stress oxidativo induz a desfosforilação do resíduo Ser967 e a fosforilação do resíduo Thr845 que são resíduos-chave na acção desta proteína e a sinalização da apoptose. O anticorpo monoclonal anti-ASK1 fosforilada é útil em investigações relacionadas com processos inflamatórios e perturbações neurológicas degenerativas.

4. Anticorpo monoclonal Anti-AGO1 – Investigação do micro-ARN

É usado principalmente para imunoprecipitação da proteína Argonauta1 (AGO1) e para a purificação do micro-RNA que actua em conjunto com esta proteína, capturado pelo RISC. A AGO1, da mesma forma que a AGO2, é um componente do complexo silenciador induzido pelo ARN (RISC) e está envolvida em numerosos processos relacionados com o ARN.

No estudo bioquímico são necessárias ferramentas como este anticorpo que permite eliminar a interferência da AGO1, por precipitação, para se poder caracterizar outras proteínas e identificar moléculas de micro-ARN. Este anticorpo apresenta reactividade cruzada com a proteína AGO1 humana e de rato.

5. Anticorpo monoclonal Anti-GST tag

A glutationa S-transferase (GST) é a enzima que catalisa as reacções de redução levadas a cabo pela glutationa que transforma o seu grupo tiol numa ponte dissulfereto, com o objectivo de eliminar espécies oxidantes que possam ser tóxicas. Esta enzima e, consequentemente, o seu anticorpo específico são usados em investigações relacionadas com o stress oxidativo e todas as doenças provocadas por esta condição. A GST integra-se em vectores de expressão para a obtenção de proteínas de fusão, melhorando a solubilidade e aumentado a expressão das proteínas que carregam a etiqueta.

6. Anticorpo monoclonal Anti-6xHis tag

Neste caso é uma cadeia de seis histidinas que são reconhecidas pelo anticorpo. A sequência de seis histidinas lineares pode coordenar catiões metálicos divalentes como o níquel e o cobre pelo que esta etiqueta, usada principalmente em cromatografia de afinidade, pode ser utilizada para a purificação de proteínas mediante a sua imunoafinidade. Para o reconhecimento desta etiqueta, a WAKO desenvolveu quatro clones que têm diferentes características e levam a cabo a união segundo a posição de fixação da etiqueta – se é a um carbono terminal ou a um azoto. Além disso, oferece-se a informação para definir que anticorpo é mais recomendável dependendo da técnica que se vai usar: imunoprecipitação, ELISA ou Western Blot.

7. Anticorpo monoclonal Anti-AGO2 de camundongo

À semelhança das proteínas Argonautas de origem humana, a AGO2 de rato é também um componente importante no complexo RISC. A AGO2 de rato participa no silenciamento pós-transcripcional dos genes. Este anticorpo também é utilizado para técnicas de imunoprecipitação, imuno-histoquímica e ensaios de Western Blot.

Apresenta reactividade cruzada com a proteína AGO2 de ratazana e de hamster pelo que é especialmente útil em investigações que usam estas espécies de animais como modelos.

8. Anticorpo monoclonal Anti Proteína C- Reactiva Humana

A proteína C reactiva humana é uma proteína de fase aguda e um mediador da actividade imune inata. A proteína é um biomarcador cardiovascular, relacionado-se com a arteriosclerose e a possibilidade de sofrer enfartes do miocárdio em pacientes de risco. Além disso, o paciente apresenta valores ainda mais elevados quando já sofreu enfartes do miocárdio ou doenças infecciosas. O anticorpo anti-proteína C reactiva humana é usado em imuno-histoquímica.

9. Anticorpo monoclonal Anti-AGE conjugado com peroxidase

Os produtos finais da glicação avançada (AGEs) originam-se no organismo por diferentes rotas metabólicas de açúcares e compostos dicarbonílicos que provocam a glicação e oxidação de proteínas, lípidos e ácidos nucléicos. Em doenças crónicas relacionadas com a idade e outras como a diabetes mellitus, ocorre uma acumulação dos AGEs que podem causar complicações nos pacientes. Estudos recentes envolvem uma resposta do sistema imunitário antes da acumulação de AGEs proteicas, pelo que se isolou este anticorpo com fins investigativos.

10. Anticorpo monoclonal Anti-P2X4

Entre os receptores ionotrópicos de ATP encontra-se a P2X4, uma proteína que participa em processos de sinalização da dor quando há lesões nos nervos periféricos. Comprovou-se que há um aumento da expressão do receptor P2X4 na micróglia após danos nervosos, no entanto, este incremento não se verifica ao nível dos neurónios.

Portanto, o bloqueio destes receptores na micróglia transformou-se num novo alvo terapêutico para o tratamento da dor induzida por lesões nos nervos periféricos.

O anticorpo monoclonal Anti-P2X4 pode ser utilizado em investigações relacionadas com a dor neuropática e patologias cardíacas.

11. Anticorpo monoclonal Anti-c-Myc tag

A sequência que reconhece este anticorpo é formada por dez aminoácidos EQKLISEEDL que formam parte do oncogene humano myc. Esta sequência é usada como tag nas proteínas de fusão, sendo uma ferramenta muito eficaz na localização de proteínas, técnicas de ELISA, imunoquímica e purificação protéica. O anticorpo monoclonal anti-c-myc tag comercializado pela WAKO foi testado em análises de Western Blot e em imunoprecipitação de proteínas com grande sucesso.

12. Anticorpo monoclonal Anti-HA tag

HA (YPYDVPDYA) é a hemaglutinina do vírus da gripe A, a proteína que o vírus utiliza para aderir às células que vai infectar. Esta etiqueta é usada para estudos sobre o vírus da gripe A humana, com o objectivo de conhecer o seu mecanismo de acção e desenvolver fármacos que sejam eficazes para o tratamento da doença. A WAKO também conta com o conjugado de peroxidase – anti-HA tag, ambos úteis na purificação e reconhecimento de proteínas de fusão marcadas com esta etiqueta.

13. Anticorpo monoclonal Anti-α-Sinucleína fosforilada

O agregado da α-Sinucleína, proteína presente nos corpos de Lewy, está associado à doença de Parkinson e a demência com corpos de Lewy. A fosforilação da α-Sinucleína no resíduo Ser129 é uma das causas do enrolamento incorrecto desta proteína, promovendo a sua agregação.

O anticorpo monoclonal Anti- α-Sinucleína fosforilada comercializado pela Wako é específico para a α-Sinucleína humana fosforilada no resíduo Ser129 e não reage com a α-Sinucleína não fosforilada.

Este anticorpo pode ser utilizado em investigações relacionadas com a doença de Parkinson e a demência dos corpos de Lewy, por exemplo para análises de Western Blot e outras técnicas de imuno-histoquímica.

14. Anticorpo monoclonal Anti-GFP

A proteína verde fluorescente GFP (do inglês, Green fluorescent protein), isolada do cnidário Aequorea victria ou “gelatina cristal” foi a primeira proteína que se usou como marcador fluorescente. Ao ser iluminada com uma luz azul, a proteína fluoresce de cor verde e adquire assim o seu nome. Apesar de se terem estudado outras proteínas para este fim, esta continua como um dos marcadores mais utilizados em investigação. Usa-se para estudar o desenvolvimento de uma determinada proteína a nível celular: observa-se quando o promotor de uma rota metabólica se activa, vê-se o crescimento de neurónios, observa-se a proliferação de vírus, entre outras aplicações. Os avanços nas técnicas de microscopia por fluorescência fizeram desta proteína uma ferramenta extremamente útil em biomedicina e, graças ao seu uso, avançou-se no conhecimento de diversos mecanismos fisiológicos. O anticorpo monoclonal anti-GFP desenvolvido pela WAKO provém de rato e tem um amplo espectro de utilização: desde ensaios de imunoprecipitação até reconhecimento de proteínas em células de C. elegans.

15. Anticorpo monoclonal Anti-Tag

Uma técnica que ganhou popularidade nas investigações biomédicas é a utilização de etiquetas ou tags para a marcação das proteínas quando se quer promover a união a um anticorpo mas esse anticorpo específico ou não existe para essa proteína ou a proteína localiza-se num meio em que é difícil o seu reconhecimento. Estas etiquetas são epítopos (parte que reconhece o anticorpo dum antigénio) de diferente natureza química: péptidos, proteínas, açúcares, entre outros. Os anticorpos que se apresentam em baixo têm todos em comum serem anti-tags. Esta ferramenta é uma chave para todas as investigações relacionadas com proteínas de fusão, que são aquelas que se obtêm para investigações biomédicas ou com fins terapêuticos pela fusão de genes que codificam diferentes proteínas.

16. Anticorpo monoclonal Anti-DYKDDDDK tag

A cadeia peptídica DYKDDDDK usa-se como etiqueta para a detecção e purificação de proteínas recombinantes de fusão.

Esta etiqueta, conhecida como Flag Tag, tem o seu nome patenteado pela Sigma-Aldrich Co. (que foi uma das primeiras empresas a utilizar a tecnologia do DNA recombinante), e permite o reconhecimento e a purificação de muitas proteínas para as quais ainda não se conta com um anticorpo específico.

O anticorpo monoclonal anti-DYKDDDDK tag apresenta uma alta especificidade e alcança uma boa reprodutibilidade dos ensaios em que intervém, além de ser um produto económico. Pode ser utilizado em análise de Western Blot para a detecção de proteínas de fusão marcadas com esta etiqueta e para imunoprecipitação. Além disso, a WAKO ainda conta com o anticorpo conjugado anti-DYKDDDDK tag – peroxidase.

ANTICORPOS MONOCLONAIS PARA INVESTIGAÇÕES

Anti-AGO2 de camundongo	Anti-P2X4	Anti-AGO2 humana