10 reagentes e acessórios para utilizar na técnica Western Blot

A técnica de Western Blot é uma das mais eficazes para transferir proteínas. Desde a sua descoberta que tem sido aperfeiçoada e aumentou o número de experiências em que é utilizada, fundamentalmente em investigações de Biologia Molecular, Imunologia e Biotecnologia. O seu nome provém das semelhanças deste procedimento com o previamente desenvolvido por um professor cujo apelido era Southern, conhecido como Southern Blotting. Para transferir proteínas mediante o método de Western Blot, realiza-se inicialmente uma eletroforese sobre gel de acrilamida, que permite a separação das proteínas contidas numa amostra e depois é aplicado um campo elétrico perpendicular ao gel e que contém as proteínas, sendo transferidas a uma membrana de nitrocelulose ou de polifluoreto de vinilideno. Ao passar a membrana pode-se proceder à identificação das proteínas que se encontram mais acessíveis e podem interagir com as moléculas que se usam no passo de identificação.

A identificação das proteínas no Western Blot realiza-se normalmente usando anticorpos, em muitas ocasiões um anticorpo primário ou um secundário. Daí esta técnica também ser denominada “Immunoblot”. O resultado produzido quando uma miscelânea de proteínas entre em contacto com anticorpos é um reconhecimento supramolecular que permite a interação específica segundo os grupos funcionais que contêm as proteínas com o anticorpo que efetua o reconhecimento. Como na Natureza, nestes ensaios as reações produzidas entre os anticorpos e as proteínas presentes na amostra em estudo são específicas. Portanto, seleccionando os anticorpos que ficam em contacto com a membrana, podem ser detetadas apenas as proteínas que interagem especificamente com eles, daí a utilidade do método, tanto para detetar numa amostra complexa uma ou várias proteínas de interesse, como para realizar o seguimento da expressão de proteínas durante o decorrer dos ensaios.

Uma vez realizado o proceso de coloração das membranas de Western Blot, procede-se à deteção das proteínas que se encontram nas bandas coloridas. É frequente realizar a deteção por colorimetria, ou seja, através da medição da intensidade da cor de cada uma das franjas.

1. PBS-T

O PBS-T é uma dissolução de lavado que contém um buffer e é utilizado tanto para Western blotting como para as placas de ELISA. Com a dissolução do lavado assegura-se que a placa a analisar contenha apenas a miscelânea de proteínas do conjunto inicial e não outros componentes.

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2. Reagente Multi Capture HRP – Anticorpo de deteção

Mediante o uso do reagente Multi Capture HRP podem-se detetar anticorpos que se unem à proteínas. A deteção pode ser realizada por quimioluminescência, já que o reagente está marcado com a proteína luminescente HRP. A sensibilidade é conseguida através da utilização do reagente Multi Captures é semelhante à obtida com anticorpos secundários disponíveis no mercado. O Kit inclui um reagente para o caso específico da deteção de IgG1 de rato, que pode ser de difícil deteção sem a ajuda deste reagente auxiliar.

3. Immunoenhancer (Potenciador da reação imunológica)

Com este reagente consegue-se acelerar a reação entre o antigénio e o anticorpo no Western blot e outras técnicas imunoquímicas. Pode ser aplicado simultaneamente com os diluentes dos anticorpos prontos a ser utilizados.

4. Skim Blocker

O Skim Blocker tem como principal função evitar a absorção não específica nas membranas ou placas de ELISA. Deve-se usar imediatamente depois de se abrir o frasco que o contém, e agitá-lo durante meia hora com a amostra à temperatura ambiente, de forma a realizar a sua função. Os reagentes bloqueadores mais usados são o soro de albumina de bovino e o leite desnatado. O leite desnatado não pode ser usado em muitas experiências onde são usados anticorpos fosforilados como agentes bloqueadores, porque contêm muitas proteínas fosforiladas.

6. Stripping Reagent

A Stripping Solution é usada para eliminar restos de anticorpos primários e secundários das membranas de Western Blot. A necessidade de utilizar esta solução é mais acentuada quando se estão analisando várias proteínas em uma membrana.

7. Fosfatase alcalina do Anticorpo conjugado Anti IgC de ratinho (H+L), de coelho e da molécula completa de IgG (Anti Mouse IgG (H+L), Rabbit, IgG Whole, Alkaline Phosphatase Conjugated)

Estes são alguns dos anticorpos secundários disponíveis nos catálogos de Wako que são úteis na técnica de Western Blot. Também se podem encontrar estes anticorpos secundários marcadas com peroxidase de rabanete picante.

8. Set de imuno-tinção POD (POD Immunostain Set)

Este Set inclui um kit para a imuno-tinção enzimática com imunoglobulinas marcadas com peroxidase de rabanete picante em membranas de nitrocelulose. Na presença do reagente corante, o fenol oxida-se mediante a reação com peróxido de hidrogénio, formando-se diformazan de cor azul escuro. Esta reacção permite a detecção quantitativa do antigénio, pois pode-se medir por colorimetria a concentração do produto colorido formado

9. Solução ABC (ABC Solution)

Também é um corante, no caso do complexo peroxidase-biotina-espreptadivina. A solução ABC reage com os anticorpos secundários marcados com biotina para formar um complexo entre o antigénio, o anticorpo primário, o anticorpo secundários e ABC. Depois adiciona-se o substrato para a detecção das bandas correspondentes às proteínas. Os antigénios podem ser detectamos com uma alta sensibilidade usando esta solução, já que os anticorpos secundários se unem a múltiplas peroxidases via espreptadivina.

10. Solução BCIP/NBT (BCIP/NBT Solution)

A solução de 5-bromo-4-cloro-3-indolfosfato (BCIP) e o nitroazul de tetrazolio (NBT) também se usa como reagente corante. O BCIP e o NBT produzem um produto insolúvel de cor azul ou de cor muito escura na presença da fosfatase alcalina. Esta reacção é utilizada para realizar a detecção de proteínas no Western Blot.

REAGENTES PARA BIOLOGIA MOLECULAR

Kit Target mRNA Cloning da Wako	GoldMAN™