10 métodos de extração de DNA

A extração de ADN realiza-se para que se obtenham moléculas de ADN isoladas com um elevado grau de pureza, a fim de poderem ser utilizadas na investigação científica, medicina, e ciência forense.

A maior parte dos métodos que existem para extrair ADN consistem na promoção da lise, ou ruptura celular, para que o isolamento do ADN do resto dos constituintes da célula seja possível.

Aquando da escolha do método de extracção de ADN a utilizar, vários factores devem ser tidos em conta:

• A quantidade de amostra de que se dispõe para a extracção do ADN.

• O tipo de amostra ou fonte da qual se quer extrair o ADN.

• O grau de pureza com que se quer obter o ADN extraído.

• O tempo que cada método consome, o seu custo e rendimento esperado.

• O uso que se vai dar ao ADN extraído.

Com a diversidade de métodos conhecidos actualmente, pode extraír-se ADN de vários substratos, tais como o sangue, a saliva, a urina e outros fluídos corporais, tecidos vivos, culturas de células, líquido amniótico, entre outros. Neste trabalho são analisadas as diferenças, vantagens e desvantagens de alguns dos métodos existentes para a extracção do ADN.

Incubação do lisado para o seu uso

Uma forma possível de isolar o ADN genómico é incubar o lisado em bruto a temperaturas entre 90 – 100ºC e usá-lo directamente. Evidentemente, mediante este método o ADN obtido apresenta um reduzido grau de pureza e número de aplicações. Outra desvantagem deste método são as perdas de ADN por acção das nucleases e outros componentes dos organelos que estão em contacto com o ADN e podem destruí-lo. Não permite armazenar o ADN, dado que os contaminantes podem degradar as suas moléculas.

Lise por ruptura mecânica e extracção com solventes mecânicos

Se se opta obter o lisado celular recorrendo a um processo mecânico, deve-se ter em conta a possibilidade de ruptura das moléculas de ADN que se tentam separar, pelo que este deve ser suficiente para que se alcance a lise celular mas não ser muito agressivo, para proteger o ADN. Este método pode ser utilizado para extrair ADN de material cru, liofilizado ou congelado, que pode romper-se com uma argamassa, por congelação-descongelação ou utilizando ultrasons. O lisado celular pode ser extraído com clorofórmio, álcool isoamílico ou fenol, sendo as proteínas e outros componentes da célula solúveis num solvente orgânico, pelo que desta forma se possibilita a separação dos ácidos nucléicos. Este método pode utilizar-se para moléculas de ADN de alto peso molecular, obtendo bons rendimentos de moléculas relativamente puras, tendo-se sempre em conta que se deve controlar o pH da fase aquosa e a concentração de sais, que são os factores que asseguram uma boa separação. As desvantagens deste método são o uso de solventes orgânicos nocivos para a saúde humana que podem ficar como vestígios na amostra de ADN e actuar, interferindo em técnicas como o PCR que é longo e em certos casos pode levar a rendimentos pouco reproduzíveis e requer várias transferências que aumentam a possibilidade de contaminação da amostra.

Lisado e purificação com um detergente iónico. Método de CTAB

Este é um procedimento básico para extraír ADN de vegetais, assenta no uso de um detergente aniónico que dissolve a parede celular atingindo-se assim a lise celular. O uso de detergentes aniónicos não se limita apenas à extracção de ADN vegetal, podendo também ser utilizado para a extracção de ADN genómico de bactérias e outros tipos de organismos. Um exemplo deste método, talvez o mais conhecido é o uso de CTAB (brometo de cetil trimetil de amónia) como detergente para a obtenção da lise. Para além disto o CTAB, na presença de EDTA como agente quelante e TRIS-HCl como tampão, forma complexos insolúveis com o ADN.1a Extraem-se de seguida os resíduos orgânicos com clorofórmio para separar, posteriormente, o ADN por precipitação com etanol. Se se quiser evitar o uso de solventes orgânicos pode-se levar a cabo o método do CTAB, separando directamente os complexos insolúveis formados com o ADN do sobrenadante onde ficaram dissolvidos o resto dos constituintes celulares. Estes complexos ficam suspensos em solução salina e adiciona-se álcool e RNAse, conseguindo-se a precipitação de ADN com um grau de pureza aceitável para muitas aplicações.

Método de salting-out

A partir de um lisado celular pode separar-se o ADN das proteínas e de outros contaminantes do ADN recorrendo à adição de altas concentrações salinas que levam à redução da solubilidade das moléculas orgânicas na fase aquosa.2a Neste método utiliza-se frequentemente a proteinase K, o TRIS-HCl para regular o pH e outros reagentes de laboratório que asseguram a total inactivação das enzimas que podem actuar sobre as moléculas de ADN. Para a extracção utilizam-se sais orgânicos como o perclorato de sódio em concentrações muito altas que fazem precipitar as moléculas orgânicas. O precipitado formado separa-se por centrifugação e pode, de seguida, extrair-se o ADN da solução aquosa mediante a adição de álcool, por precipitação. Este método é útil, mas nem sempre é eficaz, pelo que o ADN obtido deve, em muitos casos, ser purificado antes de ser novamente utilizado. A vantagem é que não é necessário recorrer à utilização de solventes orgânicos.

Utilização da proteinase K e dodecilsulfato de sódio

O procedimento conhecido como PK-SDS (sigla em inglês para proteinase K – sodium dodecyl sulfate), é um dos mais utilizados para a extracção de ADN, já que a digestão da amostra pode realizar-se com proteinase K, que é activada pelo dodecil sulfato de sódio. A proteinase K torna as DNAses presentes no lisado celular inactivas recorrendo ao detergente aniónico SDS.3a A proteinase K é também utilizada para a digestão das proteínas e de outros contaminantes do lisado celular noutros métodos descritos neste artigo.

Método de extracção de ADN com iodeto de sódio como agente caotrópico num único tubo

A empresa Wako põe à disposição dos investigadores e empresas vários kit de extração de DNA que usam iodeto de sódio como agente caotrópico, com a vantagem da extracção se realizar num único micro tubo de centrifugação. Para além de provocar a lise celular, o iodeto de sódio rompe também a capa de hidratação que envolve o ADN e que possibilita que as cargas negativas dos grupos fosfatos do ADN fiquem mais expostas. Nestes kits, após o tratamento da amostra com iodeto de sódio, adicionam-se no mesmo tubo detergentes aniónicos tais como o N-lauril sacrosinato de sódio, proteinase K e/ou outros reagentes que permitem separar as proteínas e lípidos contidos nas amostras biológicas de ADN.

Entre os kits comercializados pela Wako existem:

• Kit de extracção de ADN (DNA Extractor® Kit) para extrair ADN tanto de soro sanguíneo como de productos biofarmacêuticos.

• Kit de extração de ADN WB ( DNA Extractor® WB Kit) para a extracção de ADN genómico de amostras de sangue inteiras.

• Kit de extração de ADN TIS (DNA Extractor® TIS Kit) este kit pode ser utilizado para a extracção de ADN de tecido parenquimatoso humano e animal.

• Kit de extração de ADN SP (DNA Extractor® SP Kit) utilizando este kit pode extrair-se o ADN livre de soro e plasma sanguíneo.

• Kit isolador de ADN PS (DNA Isolator PS Kit) permite isolar o ADN em amostras de secções de tecidos embebidas ou incrustadas em parafina.

• Kit de extração de ADN FM (DNA Extractor® FM Kit) utiliza-se principalmente para a obtenção de ADN em amostras de medicina forense.

Extracção com gradientes de cloreto de cesio – brometo de etidio

O ADN genómico pode ser purificado por centrifugação selectiva através da criação de gradientes de cloro de césio. Em primeiro lugar obtem-se o lisado celular por métodos mecânicos ou químicos, e a mistura á centrifugada durante várias horas na presença de brometo de etídio. Como há brometo de etídio no centro, podem observar-se com luz ultravioleta as diferentes camadas nas quais se agrupam os ácidos nucléicos segundo a sua densidade. Obtêm-se várias camadas que podem separar-se e recuperar o ADN purificado.

Este método, apesar de permitir obter ADN de alta qualidade, apresenta várias desvantagens: é longo, impossível de automatizar, caro, requer uma ultracentrifugadora e utiliza compostos químicos tóxicos.

Troca aniónica para a extracção de ADN do lisado celular

A cromatografia em fase sólida de troca aniónica baseia-se na interacção que se estabelece entre os grupos fosfatos com carga negativa do ADN e na matriz molecular em que a coluna se compacta. Esta interacção faz com que as moléculas de ADN fiquem retidas na fase estacionária da coluna e possam separar-se das proteínas e outros metabolitos presentes. Se se adicionar de seguida uma alta concentração de sais na fase móvel, consegue-se evitar os casos em que o ADN necessita de precipitar com álcool para futuras aplicações e em que não se pode utilizar directamente dissolvido no buffer, com os sais no qual foi dissolvido. Este método tem a vantagem de não utilizar solventes orgânicos tóxicos e é mais simples do que os que requerem precipitação de outros componentes para a separação destes do ADN.

Uso de matrizes celulósicas para a extracção de ADN de amostras biológicas

Um método utilizado em investigações forenses consiste em impregnar uma matriz de celulose com produtos químicos que permitam a lise celular e posterior conservação do ADN. Para isto unem-se tampões, agentes quelantes, sais, detergentes e moléculas com grande absorção dos UV para proteger as amostras dos radicais livres que se podem formar pela exposição à luz solar. Seguindo este procedimento, as amostras podem ser conservadas por um grande período de tempo, o que é muito útil para a resolução de casos forenses e também tem utilidade na determinação de espécies num fluído corporal, como por exemplo um vírus ou uma bactéria.4

Uso de resinas de troca iónica

Para a extracção do ADN também se criaram resinas capazes de formar complexos com o ADN. O uso de resinas hidrocarbonadas com estruturas rígidas a três dimensões permite que a superfície possa conter alguma substância, como por exemplo o dietilaminoetilo que pode oxidar-se num meio ácido e ficar carregado positivamente, reagindo com os grupos fosfato do ADN. Este é um método directo, relativamente rápido e que pode realizar-se num só tubo, tendo no entanto como inconvenientes o facto de se isolarem cadeias simples de ADN e este não poder ser utilizado, por exemplo, para análise da variação de polimorfismos em fragmentos de restrição (RFLP).

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