Isolamento de exossomas em investigações genéticas com Kits de reagentes de Wako

Os exossomas podem ser encontrados em diversos fluidos biológicos, como o sangue, a saliva ou o leite materno. Estes são pequenas vesículas que contêm proteínas, RNAm, RNAmi, DNA e lípidos no seu interior, e são secretadas por vários tipos de células. Nos exossomas também se encontram enzimas capazes de degradar os diferentes tipos de RNA, pelo que uma das suas funções consiste na degradação deste tipo de moléculas. Foi comprovado que os exossomas participam na comunicação que tem lugar entre as células, pelo que são estudados como mensageiros e biomarcadores de algumas doenças. O uso dos exossomas para isolar biomarcadores de doenças difíceis de estudar, como por exemplo as doenças do sistema nervoso, devido à inacessibilidade do cérebro, ou o estudo do cancro, tem um futuro promissor. Um dos desafios atuais é conseguir separar estas vesículas extracelulares de maneira eficiente, para poderem ser usadas no estudo do seu conteúdo molecular.

Para a separação dos exossomas utilizaram-se, convencionalmente, métodos como a ultracentrifugação, a precipitação e a purificação por afinidade, usando um antigénio de superfície. Os inconvenientes do uso destes métodos tradicionais são o baixo rendimento da separação, a escassa pureza dos exossomas obtidos e problemas de operabilidade. A empresa Wako, provedora de reagentes para laboratório, oferece um Kit para a separação de exossomas chamado MagCapture™ (MagCapture™ Exosome Isolation Kit PS), o qual se baseia num método de purificação, uma vez que faz uso de partículas magnéticas e a proteínas de afinidade fosfatidilserina. Apesar deste método ser classificado como um método de afinidade como o método tradicional, obtêm-se exossomas com um elevado grau de pureza e pode ser usado para separar outras entidades vesiculares de meios de cultivo celulares e de fluidos corporais. A operabilidade do método também melhora comparando com os tradicionais, pois fazendo o uso de uma microcentrifugadores obtêm-se bons resultados.

Outra vantagem do uso do Kit de separação de exossomas MagCapture™ é que as vesículas são obtidas intactas, já que para serem separadas das partículas magnéticas com as que se separam são utilizados agentes quelantes metálicos, trabalhando a pH neutro. Os exossomas separados mediante o Kit MagCapture™ podem ser usados em diversas aplicações, como por exemplo a análise por microscopia eletrónica, a análise granulométrica e a análise molecular do conteúdo das vesículas.

Vantagens do uso do Kit para a separação de exossomas MagCapture™:

• As vesículas são separadas mediante a afinidade na superfície de uma membrana de fosfatidilserina.

• As condições para a eluição são suaves, não afetam a integridade das vesículas, é realizado a pH neutro usando um agente quelante de um ião metálico.

• Não é necessária a ultracentrifugação e o uso de partículas magnéticas melhora o rendimento e a qualidade do processo, quando comparado com os métodos tradicionais.

•  Apresenta-se um protocolo otimizado, com o qual é conseguida uma grande reprodutibilidade.

Para comparar o uso de MagCapture™, para o isolamento de exossomas com métodos convencionais como a ultracentrifugação e o método de afinidade a um antigénio de superfície, realizaram-se extracções do soro sanguíneo humano seguindo as três técnicas e logo utilizando Western Blot com os anticorpos: anti-CD9, anti-CD63 e anti-CD81, todos eles anticorpos marcadores de exossomas. O isolamento de exossomas com MagCapture™ produz melhores rendimentos do que os obtidos com ultracentrifugação e do que com o método de afinidade a um antigénio de superfície. Este estudo demonstra que para os investigadores usarem o MagCapture™ Exosome Isolation Kit PS não só levará a benefícios económicos, como também poderão obter vesículas mais puras e com maior rendimento, do que com o uso de métodos convencionais.

Wako Chemicals oferece uma ampla variedade e reagentes químicos para investigações em laboratório, desde o Kit de extração de DNA até reagentes para estudo da doença de Alzheimer. Contácte-nos se precisar de alguns dos reagentes mencionados neste blog, ou de alguma informação adicional.

Bibliografia:

1) M. Colombo, G. Raposo, C. Thèry, Annu. Rev. Cell Dev. Biol., 30, 255–89, 2014.

2) Schilders et al., International review of cytology, 251, 159-208, 2006.

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