Kit de reagentes SLP
Kit de reagentes SLP – Detecção de microorganismos (detecta peptidoglucano de bactérias e fungos)
USO PREVISTO
O kit de reagentes SLP da Wako se destina ao uso para a detecção de peptidoglucano e (1 3)-D-glucano.
RESUMO E INFORMAÇÕES GERAIS
A hemolinfa Do bicho da seda (Bombyx mori) contém um mecanismo de autodefesa que é denominado sistema em cascata da profenoloxidase. Diante da invasão de um corpo estranho, como fungos ou bactérias, o sistema em cascada participa da formação de melanina, que é observada nos fluidos corporais de insetos, para protegê-los do ataque do invasor. O peptidoglucano (PG) das bactérias e o (1 3)- -D-glucano ( -glucano) dos fungos e das leveduras acionam o sistema, e consequentemente, a profenoloxidase é ativada no sistema.
Também se acredita que as serinas proteases em série participem da cascata, mas esse ponto não foi esclarecido.
O plasma da larva do bicho da seda (SLP), do inglês silkworm larvae plasma) é preparado de maneira estéril e contém todos os fatores que participam da ativação do sistema em cascata. Este sistema, reconstituído com uma solução contendo L-3,4-dihidroxifenilalanina (DOPA) como substrato de fenoloxidase, é ativado por um PG e/ou -glucano.
A DOPA, oxidada pela fenoloxidase, forma o pigmento da melanina na mistura da reação. O PG é um componente da parede celular da maioria das bactérias e o –glucano é comumente encontrado na parede celular de uma grande variedade de fungos. Portanto, o SLP permite quantificar ou detectar a contaminação bacteriana e fúngica por meio da determinação do desenvolvimento da formação de melanina no ensaio.
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DADOS
CARACTERISTICAS
1. Cuantificación y detección sensibles de PG y -glucano.
2. Cuantificación sensible y exacta de PG y -glucano mediante el uso de un lector de microplaca o Toxinómetro.
3. Detección visual de contaminación bacteriana y fúngica sin ningún aparato especial.
4. El SLP en forma liofilizada es estable a 2- 10 ºC durante un mínimo de 18 meses
PRINCIPIO
El mecanismo de activación de SLP es como se muestra en la Figura 1.
La PG o el glucano se unen a la proteína de reconocimiento llamada PGRP o GRP. El sistema de cascada de la profenoloxidasa se convierte en fenoloxidasa. La fenoloxidasa cataliza la oxidación del DOPA que es seguida por la formación de melanina en la mezcla.
Se puede calcular visualmente la reacción por el cambio de coloración de la mezcla de reacción después de un cierto periodo de tiempo, debido al desarrollo de un color negro.
Cuando se usa un lector de microplacas o Toxinómetro, se puede cuantificar el PG o el glucano midiendo el tiempo desde el inicio (Ta) de la reacción y el cambio de absorbancia ocasionada por el cambio de coloración desde el inicio de la reacción hasta un nivel predeterminado.
REACTIVOS
Todos los reactivos deben almacenarse a 2-10 ºC.
1. SLP, liofilizado, 1 vial de 3 mL
Destinado para uso con lector de microplaca o tests visuales, rinde para aproximadamente 50 pruebas. Destinado para usarse con un Toxinómetro, rinde para aproximadamente 30 pruebas.
Sensibilidad: En cada lote se indican los criterios de valoración determinados por el test visual descrito a continuación después de 1 hora de incubación a 30 ºC con PG y -glucano.
2. Sustrato, liofilizado, 1 vial de 3 mL
Contiene DOPA como sustrato de fenoloxidasa.
3. Diluyente, 1 vial de 4 mL
Contiene una buena solución amortiguadora.
Preparación de reactivos
- Añadir 3 mL de diluyente al sustrato. Agitar suavemente la mezcla para disolver el sustrato por completo. Evitar mojar el tapón de goma.
- Añadir toda la disolución de sustrato reconstituida al vial de SLP liofilizado. Agitar suavemente hasta disolver por completo el producto liofilizado. De nuevo, evitar mojar el tapón de goma. La disolución resultante es la disolución de prueba de SLP.
PROCEDIMIENTO
1. Test visual con microplaca
1. Hacer una serie de dilución doble con el material de referencia de PG o –glucano, añadir 0.05 mL de cada dilución y colocar la muestra en los pocillos de la microplaca.
2. Volcar 0,05 mL de la disolución de prueba de SLP en cada pocillo.
3. Después de agitar suavemente, incubar la placa a 30ºC durante una hora.
4. Evaluar visualmente la formación de melanina en la mezcla de reacción: es una muestra positiva si se observa la formación de melanina y las otras muestras son negativas.
5. La concentración mínima del material de referencia en el cual se forma la melanina se define como el criterio de valoración de la disolución de prueba de SLP.
6. La determinación de si la muestra es negativa o positiva dependerá de si la concentración de los materiales reactivos de SLP que contiene la muestra es mayor o no, que la concentración del criterio de valoración.
2. Procedimiento con lector de microplaca
1. Se colocan 0.05 mL de las muestras y de las series de dilución de un material de referencia de PG o -glucano en cada pocillo de la microplaca.
2. Añadir 0.05 nM de la disolución de prueba de SLP en cada pocillo. Se recomienda el uso de un dispensador esterilizado consecutivo.
3. Leer la absorbancia del lector de la microplaca en las siguientes condiciones:
Absorbancia de la valoración: 650 nm
Modo de valoración: Cinético
Tiempo de inicio: 90 minutos
Temperatura de la valoración: 30
Automezcla: Una vez
4. La curva estándar se traza con una regresión log-log: eje horizontal: concentración de material de activación de SLP; eje vertical: tiempo de inicio.
5. Se calcula la concentración de material reactivo de SLP a partir del tiempo de inicio determinado con la curva estándar.
3. Procedimiento con Toxinómetro
Cuando se utiliza el Toxinómetro para la prueba de valoración con SLP, se puede efectuar el procedimiento de la misma manera que la valoración de endotoxinas descrita en el manual del operador. El Toxinómetro puede exhibir una señal que indique falta de luz de transmisión en la mezcla de reacción de la muestra activada. Ignore esta alarma. Los resultados no resultan afectados por la alarma.
Notas para el uso de SLP
1. Los aparatos deben esterilizarse con calor seco a 250ºC durante al menos 2 horas y no deben contener ninguna contaminación con material de SLP reactivo.
2. Después de la reconstitución, almacenar las disoluciones de prueba de SLP a 0-4 ºC y usarlas lo más pronto posible.
3. Preste especial atención para evitar la contaminación de los aparatos con material de activación del SLP durante el almacenamiento.
4. La sensibilidad de la disolución de prueba del SLP está influida en gran medida por la fuerza iónica.
5. Este equipo solo es para el uso en investigación y no tiene utilidad en procedimientos de diagnóstico.
6. Solo para uso in vitro. No es para uso interno en seres humanos o animales.