Extração de DNA WB

Extração de DNA genômico / Método com utilização de NaI 

É um requisito essencial obter DNA genômico macromolecular do sangue total, culturas de células e cultura de tecidos para análise genética dos genomas e outros procedimentos de biologia molecular. Vários dos procedimentos de purificação do DNA envolvem processo perigosos como a extração com fenol/clorofórmio, ou são procedimentos muito lentos e ineficientes, como a diálise prolongada e a transferência de DNA de um tubo para outro.

O extractor WB de DNA da Wako utiliza um procedimento simples de extração que não é perigoso para a purificação de DNA depois da lise celular. Este procedimento, que usa iodeto de sódio (NaI) como agente caotrópico, permite isolar o DNA intato de grande pureza e com alta produção. A extração é realizada com várias centrifugações rápidas em um só tubo de microcentrifugação.

Outro produtos:

 

DADOS

 

REAGENTES (50 250 ENSAIOS)

Um kit inclui:

  • 290 50511 Solução de lise, 65 ml, 2 frascos
  • 297 50521 Solução de reação enzimática, 10 ml,  1 frasco
  • 294 50531 Solução de iodeto de sódio, 15 ml,  1 frasco
  • 291 50541 Solução de lavagem (A), 50 ml,  1 frasco
  • 298 50551 Solução de lavagem (B), 50 ml,  1 frasco
  • 295 50561 Protease, 10 mg, 1 frasco

 

MATERIAIS E APARATO

Reagente:

  • Álcool isopropílico 26 ml
  • Água destilada deionizada 0,6 ml

Aparato:

  • Microcentrífuga (Max. 12.000g)
  • Tubos microfuga com tampa rosqueável (1,5 ml)
  • Misturador de tubo microfuga

Observação: Durante o armazenamento, se acontecer de a solução de reação enzimática e a solução de NaI cristalizarem , aqueça o precipitado completamente a 50º.C para solubilizá-lo. .

PRINCÍPIO DA EXTRAÇÃO DE DNA

O procedimento inclui três etapa principais: 1) Isolamento da fração do núcleo. 2) Liberação do DNA, 3) Purificação do DNA.

Na primeira etapa, as células são lisadas por um surfactante não iônico, éter de polioxietileno (10) oxifenil, seguido por uma rápida centrifugação. Com a repetição da operação, a maior parte das macromoléculas celulares, inclusive RNAs, é removida da fração do núcleo. Na etapa seguinte, a fração do núcleo é tratada com protease na presença de dodecil sulfato de sódio 1 % por 1 hora. Com esse tratamento, o DNA contido no núcleo é expandido e liberado da proteção do núcleo. Simultaneamente, a proteína da solução é digerida em polipeptídeo. Na etapa final, a solução resultante é submetida à extração de DNA com NaI conforme descrito na literatura. O polipeptídio e outras moléculas biológicas permanecem solúveis em uma alta concentração de Nal, um sal caotrópico, mesmo depois do acréscimo der isopropanol à solução para precipitar o ácido nucleico.

Armazenamento:

Em temperatura de 2-10ºC.

Preparação do reagente

A protease deve ser reconstituída com o acréscimo de 0,6 ml de água destilada deionizada. A solução de protease reconstituída pode ser armazenada a 20º. C.

ESQUEMA I: PROCEDIMENTO DE EXTRAÇÃO DE DNA DO SANGUE TOTAL

  1. 0,5 ml de sangue total, preparado com EDTA-Na2 como anticoagulante, deve se colocado em um tubo de microcentrifugação de 1,5 ml com tampa rosqueável e colocado na posição vertical em gelo.
  2. Depois de acrescentar 0,5 ml de solução de lise e tampar o tubo, inverta o tubo várias vezes para misturar suavemente a solução.
  3. Depois de uma rápida centrifugação (10.000 xg. 20 segundos a 4 ), remova cuidadosamente o sobrenadante, mantendo o precipitado vermelho escuro intacto.
  4. Acrescente 1 ml de solução de lise ao tubo e coloque o tubo tampado em um misturador de tubo para microcentrífuga por 30 segundos em velocidade moderada.
  5. Remova o sobrenadante do tubo após uma rápida centrifugação da mistura a 10.000 g por 20 segundos a 4 .
  6. Repita as etapas 4 e 5.
  7. Suspenda a massa resultante em 200 l de solução enzimática. Acrescente 10 ml de solução de protease à suspensão e misture suavemente por inversão.
  8. Incube a mistura a 37º C por 1 hora. (Durante a incubação, misture a solução várias vezes invertendo o tubo.)
  9. Após incubação de 1 hora , acrescente 0,3 ml de solução de Nal à mistura e misture bem invertendo o tubo
  10. Adicione 0,5 ml de álcool isopropílico à mistura e misture bem até que DNA, um material esbranquiçado, apareça.
  11. Depois da centrifugação a 10,000 xg por 10 minutos em temperatura ambiente, remova cuidadosamente o sobrenadante resultante. Coloque o tubo de ponta cabeça para remover a solução remanescente da superfície do tubo.
  12. Enxágue a massa no tubo acrescentando 1 ml de solução de lavagem (A) ao tubo seguido por centrifugação (10,000 xg, 5 minutos). Misture totalmente de maneira que a massa seja removida da parede do tubo.
  13. Repita a mesma operação descrita cima utilizando a solução de lavagem (B) ao invés da solução de lavagem (A).
  14. A massa resultante deve ser submetida à secagem a vácuo por cerca de 3 minutos. (A secagem deve ser realizada no prazo de 3 minutos porque o DNA totalmente seco pode ser difícil de dissolver).

 

ESQUEMA II :PROCEDIMENTO DE EXTRAÇÃO DE DNA DE CULTURA DE CÉLULAS (EXEMPLO:HELA, SQ-5)

  1. A massa de células de cultura (103 106 células) como HeLa e SQ-5, coletada em tubo de microcentrífuga de 1.5 ml deve ser suspensa em solução de lise de 1 ml e, em seguida, colocada com o tubo tampado em um misturado de tubos de microcentrífuga.
  2. Siga as etapas 5-14 descritas no procedimento para extração de DNA de sangue total

APLICAÇÃO DO KIT WB DE EXTRAÇÃO DE DNA NO PROCEDIMENTO DE REDUÇÃO DE VOLUME

DNA
genômico foi extraído de 100 ml de sangue total com o kit WB de extração de DNA utilizando menores volumes de reagentes do que com o procedimento padrão. Nesses procedimentos, foram utilizados 1/5 ou 1/4 dos volumes originais de reagentes, os tubos de microcentrífuga eram de 0,6ml. Como referência, o DNA genômico foi extraído de 500 ml de sangue total utilizando o procedimento padrão

 

DNA genômico