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Uso de Phos-tag para a avaliação fosfoproteômica

30th June 2017

Phos-tag™ no campo da fosfoproteômicaA fosforilação é uma modificação pós-traducional reversível, chave nos processos biológicos dos organismos procariotas e eucariotas. Ocorre principalmente nos resíduos de histidina, ácido glutâmico e ácido aspártico em células procarióticas; no entanto, em eucariotas, ocorre em serina, treonina e tirosina.

As mudanças nos estados de fosforilação das proteínas afetam muitos eventos celulares e estão envolvidas em inúmeras patologias. É por isso que nos campos da biologia e da medicina, o processo de enriquecimento rápido e específico da fosforilação natural a partir de amostras biológicas complexas é de grande importância.

A fosfoproteômica é o estudo da fosforilação das proteínas (FP) que fazem parte da célula ou tecido em um determinado estado. Atualmente, as abordagens fosfoproteômicas constituem uma poderosa ferramenta para estudar a resposta celular, tanto globalmente como individualmente, de uma determinada proteína. Seu principal objetivo, aplicando as técnicas fosfoproteômicas, é a extração de todas as proteínas fosforiladas dos lisados celulares e/ou tecidos para identificar aquelas fosfoproteínas de menor nível de expressão. Além de identificar todas as quinases e fosfatases envolvidas nestes processos biológicos complexos.

Entre os métodos mais úteis para o estudo da FP e peptídeos são: marcação radioativa, cromatografia de afinidade utilizando íons metálicos, espectrometria de massa, anticorpos fosfoespecíficos (AcF) e outros.

Recentemente, a tecnologia Phos-tag™foi desenvolvida para superar as desvantagens e limitações dos AcF. Existem anticorpos de ligação para tirosinas, serinas e treoninas fosforiladas que são usados em combinação com testes de imunopreciptação e imunoblot. Verificou-se que alguns fosfoanticorpos possuem um baixo desempenho e alguma inespecificidade, com exceção dos que reconhecem resíduos fosforilados independentemente da sequência peptídica, por exemplo, os anticorpos anti-tirosina.

Phos-tag™é uma molécula única desenvolvida para imitar o centro ativo de uma fosfatase alcalina. Seus derivados conjugados com biotina, acrilamida ou agarose formam complexos que podem capturar, reversivelmente e seletivamente, diânions de monoéster de fosfato unidos a resíduos de serina, treonina e tirosina, em solução aquosa e a valores de pH neutro. Seu índice de seletividade aniônica para o diânion de fosfato é cerca de 10.000 vezes maior do que sua seletividade para o monoânion de acetato, o que permite seu uso no enriquecimento de compostos biológicos fosforilados em pH fisiológico em intervalos curtos de tempo.

Entender o processo de fosforilação e identificar todas os sítios fosforilados e as enzimas envolvidas é inestimável para a descoberta de novos medicamentos e diagnóstico de doenças, assim como seu prognóstico. Doenças como Alzheimer, na qual considera-se que a toxicidade de β-amiloide é mediada pela proteína Tau fosforilada; ou sobre os vários tipos de câncer, em que a alta fosforilação de determinadas proteínas é um fator crítico no desenvolvimento e progresso da doença e da metástase.

A Empresa Wako, uma empresa distribuidora de reagentes para laboratórios, oferece em seu catálogo os produtos da série Phos-tag™ para os pesquisadores no campo da fosfoproteômica, que descreveremos abaixo:

O produto Phos-tag™ Acrilamida AAL-107, para uso em eletroforese de gel de SDS-PAGE, é capaz de separar as formas fosforiladas e não-fosforiladas simultaneamente. Ao poder ser utilizado independentemente do tipo e da sequência de aminoácidos, através do seu uso podem ser analisadas tanto fosfoproteínas desconhecidas como detectar novos sítios fosforilados. Além disso, pode ser usado nas análises de Western blot, Espectrometria de massa e Eletroforese 2D.

Wako dispõe de Phos-tag™ Agarose para a purificação de proteínas usando cromatografia de afinidade. Constitui uma coluna de cromatografia para a separação, purificação e concentração de proteínas fosforiladas, que pode ser obtida em condições similares ao in vivo por ser uma coluna livre de surfactantes e agentes redutores.

Phos-tag™ Biotina para a detecção de proteínas fosforiladas em membranas PVDF por Western Blotting possuem, por sua vez, 3 produtos listados: Phos-tag™ BTL 104, Phos-tag™ BTL 105 e Phos-tag™ BTL 111. Sendo o último, o de maior sensibilidade. A Wako recomenda o uso deste produto quando não existem disponíveis os anticorpos anti-fosforilados independentemente do tipo de fosforilação.

Por último, mas não menos importante, temos Phos-tag™ SuperSep Gel. O produto é um gel, pronto para uso, em técnicas de eletroforese e com um mecanismo semelhante ao gel de SDS-PAGE. Contém zinco como metal complementar e é de armazenamento de alta estabilidade. A Wako recomenda o uso do Marcador pré-corado de Proteínas WIDE-VIEW™ III para evitar a distorção das bandas. Além disso, executar um processo com EDTA antes da transferência quando é realizado o Western Blotting. Phos-tag™ SuperSep Gel consiste de uma grande variedade de géis específicos para os tanques eletroforéticos Bio-Rad, Life Technologies e EasySeparator™ da Wako, também disponível através do site da empresa.

Bibliografia:

1) Chad A. Dumstorf, L. E. (2016). Abstract 3919: Phosphorylation of eIF4E is a critical factor in development and progression of breast cancer in women. Cancer Research, 76(14).

2) Emiko Kinoshita-Kikuta, E. K. (2016). Phosphopeptide Detection with Biotin-Labeled Phos-tag. Phospho-Proteomics, 1355 of the series Methods in Molecular Biology, 17-29.

3) Kinoshita, E. K.-K. (2015). Phos-tag-Based Affinity Chromatography Techniques for Enrichment of the Phosphoproteome. En Protein Modifications in Pathogenic Dysregulation of Signaling (págs. 17-30).

4) López-Villar, E. N.-C.-L. (2008). Metodologías fosfoproteómicas útiles en estudios clínicos. Revisión Inmunología, 27(1), 36-44.

5) Takahiro Horinouchi, K. T. (2016). Using Phos-ta in Western Blotting Analysis to Evaluate Protein Phosphorylation. Kidney Research, 1397 of the series Methods in Molecular Biology, 267-277.


Por: Adriana Clegg Em: Produtos Wako